NGS 실험 원리 — 분자에서 읽기까지

분자정보공학 · 2026-10-31 · 준비 → 증폭 → 화학 → 검출 → 오류

회사의 이름보다 “한 점에 무엇이 들어 있고, 어떤 반응을 무엇으로 측정하는가”를 먼저 본다. 아래 도식은 단계별 반응을 설명하기 위한 자체 모형이며 분자 크기와 신호 세기는 비례하지 않는다.

Pyrosequencing · 454

염기가 붙을 때 나온 PPi를 빛으로 바꾼다.

454 · 같은 서열의 비드 → 웰 → PPi 연쇄 → 발광PicoTiterPlate 웰비드 위 동일한 DNA 사본dATP 흐름 ↓중합효소주형 3′–TTT–5′신생 5′–AAA–3′3 PPi3 ATP+ 3 APSATP sulfurylase빛luciferase + luciferin + O₂동일 염기가 3개 붙으면 신호도 약 3배: 길이를 세기로 추정

  1. 준비

    어댑터를 붙인 DNA를 희석해 비드·액적에 분리한다. ePCR로 한 주형의 여러 사본을 같은 비드에 만든다. 신호를 키우기 위한 클론 증폭이다.

  2. 반응 위치

    증폭 비드를 작은 웰에 나누어 놓고 효소·시약을 공급한다. 주형이 섞인 비드는 혼합 신호를 만들므로 점유 제어가 중요하다.

  3. 화학

    한 종류 dNTP가 주형과 맞으면 중합효소가 도입하고 PPi를 낸다. PPi+APS를 ATP sulfurylase가 ATP로 바꾸고 luciferase가 발광 반응에 쓴다.

  4. 신호·재시작

    빛의 세기로 도입량을 추정한다. 고전 pyrosequencing은 apyrase로 잔여 기질을 분해한다. 454의 세척·효소 운용은 고전 소규모 반응과 구분한다.

  5. 오류·확인 질문

    AAAA 같은 구간은 한 flow에 여러 염기가 붙어 세기가 커진다. 신호량의 비선형성과 잡음 때문에 반복 수 indel이 생긴다. “네 번의 촬영” 없이 A 네 개를 어떻게 구분할까?

Ronaghi et al., Science (1998), doi:10.1126/science.281.5375.363 · Margulies et al., Nature (2005), doi:10.1038/nature03959

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영상 열기 · DaftPunkCA · Genome Sequencer FLX System Workflow

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Illumina SBS

한 주기에 한 염기를 도입하고 촬영한 뒤 다시 출발한다.

Illumina SBS · 한 사이클에 한 염기 · 3′ 보호기는 되돌림주형 (오른쪽으로 3′→5′)3′TGCAT5′5′ACG3′TT가 A 맞은편으로 들어옴염기에 형광 · 3′-O에 보호기T3′한 염기 편입 후 일시 정지신생 가닥 말단: 3′-O-R카메라: T 신호한 점은 한 분자가 아니라 같은 서열의 클러스터염료·3′ 보호기 제거3′-OH 회복 → 다음 사이클ddNTP의 3′-H와 화학 구조가 다름표면 / flow cell클러스터 안의 대표 DNA 한 쌍을 확대

  1. 준비

    분절 DNA 양끝에 어댑터를 붙인다. 어댑터에는 flow cell 결합·sequencing primer·시료 index에 필요한 구조가 들어간다. Index는 데이터 payload와 별도다.

  2. 클러스터

    고전 bridge 증폭은 표면에서 같은 서열의 클론을 만든다. 현대 patterned flow cell은 정해진 nanowell과 해당 증폭 chemistry를 쓴다. 둘을 같은 도식으로 단정하지 않는다.

  3. 화학

    표지와 제거 가능한 3′ 차단기를 가진 기질을 공급한다. 상보 염기 하나가 들어간 뒤 가닥이 잠시 멈춘다. 생어 ddNTP처럼 3′ 산소가 없는 영구 종결은 아니다.

  4. 촬영·반복

    점별 형광 이미지를 얻고 표지·차단을 제거해 3′-OH를 복구한다. 다음 염기로 반복한다. NovaSeq X는 blue/green 2채널, MiSeq i100은 세 염료·두 이미지 구현을 구분한다.

  5. 오류·확인 질문

    사본들의 phasing, 약한 신호, 색 분리·낮은 diversity가 품질에 영향을 준다. R1·index·R2를 언제 읽는지 그려 보자. 기기 동작 영상에서 화학 반응 자체는 직접 보이는가?

Illumina · SBS technology · Illumina · Patterned flow cells · Illumina · NovaSeq X chemistry and imaging

영상 열기 · Illumina · Overview of Illumina Sequencing by Synthesis Workflow | Standard SBS chemistry

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영상 열기 · Illumina · Illumina | Patterned Flow Cell Technology

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영상 열기 · Illumina · Illumina MiSeq™ i100 Series | Introduction to starting a run

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ABI SOLiD

중합효소의 도입 대신 DNA ligase로 프로브를 잇고 두 염기 정보를 읽는다.

SOLiD · 두 염기 프로브를 연결하고 색으로 읽음3′–primer–5′-P5′–adapter–target sequence–3′ (주형)NNNNNXXXHO-3′5′–염료ligase① 맞는 프로브 선택 → ② 연결 → 형광 측정③ 절단: 염료와 끝 3 nt 제거5 nt가 남아 다음 연결로 진행④ 프라이머 시작점을 1 nt씩 바꾸어 총 5라운드각 염기를 겹쳐 조사 · 한 색 = 가능한 두 염기 조합 4개

  1. 준비

    어댑터 DNA를 ePCR로 비드에 클론 증폭한다. 비드를 공간적으로 분리해 각각의 형광 신호를 추적한다.

  2. 시작

    고정된 어댑터에 sequencing primer를 붙인다. 색이 붙은 짧은 oligo probe 혼합물을 넣는다.

  3. 인식·연결

    probe의 특정 두 염기가 주형과 맞는지 ligase의 연결 반응으로 검사한다. 한 색은 단일 A/C/G/T가 아니라 두 염기의 조합 정보를 인코딩한다.

  4. 촬영·절단·재프라이밍

    연결된 probe를 촬영하고 표지 쪽을 절단해 다음 연결을 준비한다. 몇 회 반복 후 primer 시작점을 옮겨 다른 위치의 정보를 얻는다.

  5. 오류·확인 질문

    color space에서 base space로 변환할 때 알려진 시작 염기와 이웃 색의 일관성이 중요하다. “한 색=한 염기”로 읽으면 왜 틀리는지 설명하자.

Shendure et al., Science (2005), doi:10.1126/science.1117389

영상 열기 · King of Biotech · SOLiD DNA Sequencing

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Ion Torrent

합성으로 생기는 H⁺를 반도체 센서로 감지한다.

Ion Torrent · DNA 편입 → H⁺ → pH → 센서 전압주형·프라이머 클론 비드마이크로웰dNTP 한 종류씩 ↓H⁺H⁺ISFET 센서대조 웰과 pH 변화 비교빛·형광·카메라가 필요 없음염기 편입 수 → 전압 신호 크기123동일 염기 편입 수 (교육용 모형)

  1. 준비

    어댑터 DNA를 비드에 ePCR 증폭한다. 비드를 반도체 칩의 작은 웰에 배치한다.

  2. 반응

    dNTP를 한 종류씩 공급한다. 주형에 맞는 염기가 들어가면 중합 반응과 관련된 H⁺ 신호가 생긴다.

  3. 검출

    센서가 국소 pH 변화를 전기 신호로 바꾼다. luciferase나 형광 카메라를 사용하지 않는 점이 454·Illumina와 다르다.

  4. 반복

    세척·다음 기질 공급을 반복한다. 같은 염기가 연속되면 한 flow에 여러 염기가 도입될 수 있다.

  5. 오류·확인 질문

    큰 신호를 긴 호모폴리머로 바꾸는 추정이 어려워 indel에 주의한다. 빛을 쓰지 않아도 클론 증폭이 필요한 이유는 무엇일까?

Rothberg et al., Nature (2011), doi:10.1038/nature10242

영상 열기 · Thermo Fisher Scientific · Ion Torrent Next-generation Sequencing

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Helicos 단일분자 SBS

클러스터 대신 표면의 한 DNA 분자를 직접 관측한다.

Helicos · 증폭 없이 DNA 한 분자의 편입을 관찰3′AAAAACGT5′5′TTTTT3′poly(A) 꼬리가 있는 단일가닥 주형표면 / flow cell표면 poly(T) 프라이머GG 흐름: 주형 C에 상보적 편입클론 증폭이 아닌 단일분자 신호TIRF 형광 관찰염료·차단 부분 제거다음 염기 종류의 흐름으로 진행짧은 read도 단일분자일 수 있음

  1. 준비

    DNA 말단과 표면의 결합 구조를 이용해 단일 주형을 떨어뜨려 고정한다. 위치별 형광 신호가 한 분자에서 나와야 한다.

  2. 차이

    클론 증폭이 없으므로 PCR 증폭 편향을 줄일 수 있지만 신호가 약하고 한 번의 누락도 read에 직접 영향을 준다.

  3. 도입·관찰

    형광 기질의 도입을 반복 촬영한다. 자유 형광 기질의 배경을 줄이고 고정 위치 신호를 찾아야 한다.

  4. 재시작

    표지 제거와 다음 반응으로 같은 분자를 이어 읽는다. 초기 상용 단일분자 방식과 현대 긴 판독의 성능을 같은 것으로 취급하지 않는다.

  5. 오류·확인 질문

    형광 신호의 누락·오인과 분자 유지가 중요하다. 단일분자라는 말이 왜 자동으로 long read나 높은 정확도를 뜻하지 않는가?

Harris et al., Science (2008), doi:10.1126/science.1150427

영상 열기 · WIRED · Helicos High Speed Gene Sequencing

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DNBSEQ · RCA DNA 나노볼

원형 DNA를 반복 복제해 작은 DNA 공을 만들고 배열에서 판독한다.

DNBSEQ · 원형 주형 → RCA → 나노볼 → cPASssDNAcircle삽입 DNA + adapterφ29 · RCA / RCR[insert][insert][insert]…하나의 긴 반복 ssDNADNA 나노볼패턴 배열 · 형광 cPASDNB 형성의 증폭과 판독 화학을 구분 · 초기 CG의 cPAL과도 구분

  1. 원형화

    주형과 어댑터를 원형 단일가닥 구조로 준비한다. 선형 잔여물 제거와 정량은 라이브러리 품질에 중요하다.

  2. RCA

    중합효소가 원형 주형을 여러 바퀴 돌아 같은 정보를 이어 복제한다. 긴 사본이 접혀 DNB를 만든다. RCA는 증폭 단계다.

  3. 배치

    DNB를 patterned array의 정해진 위치에 올려 점별 신호를 분리한다. Illumina의 표면 클러스터 생성과 위치·형성 과정이 다르다.

  4. 판독

    현대 DNBSEQ는 cPAS로 anchor·probe와 합성 신호를 이용한다. 초기 Complete Genomics 논문의 cPAL 라이게이션과 기술 세대를 구분한다.

  5. 오류·확인 질문

    DNB의 균일도·배치·광학적 혼합·basecalling이 품질을 좌우한다. Element도 RCA를 쓰지만 왜 판독 화학은 같은 것이 아닐까?

MGI · DNBSEQ technology · Drmanac et al., Science (2010), doi:10.1126/science.1181498

영상 열기 · MGI · MGI's Proprietary DNBSEQ™ Technology

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현대 기술의 비교 — RCA는 읽기 화학이 아니다

방법신호 확대염기 인식
MGI DNBSEQ원형 DNA → RCA → DNBcPAS
Element AVITI원형 DNA → 표면 RCA polonyAvidite 다중 결합 인식 + 별도 신장
Singular G4X클론 신호4색 Rapid SBS
역사적 Onso클론 신호SBB; 현재 PacBio 공급 종료 안내
Ultima클론 비드·open wafer대부분 자연 기질의 flow 기반 mnSBS

Element · Avidite base chemistry · Singular · Rapid SBS on G4X · PacBio · SBB (Onso 공급 종료 안내 포함) · Simmons et al. · mnSBS 원저 (2023) · Ultima · 현재 플랫폼

영상 열기 · Element Biosciences · 2 of 4 | Sequencing on the AVITI™ - Unique Chemistry

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장비 실물·현재 제품·특허·비교표를 포함한 60분 강의로 이동

데이터로 넘어갈 때

공통 출력은 염기서열과 품질값이다. FASTQ 품질, 실제 유효 read 수, 표적별 깊이, 오류 패턴을 먼저 확인한 뒤 목적에 맞춰 정렬·조립·정량·디코딩을 선택한다. RNA-seq의 TPM과 DNA 저장의 가닥별 읽기 깊이는 서로 다른 지표다.

라이브러리·FASTQ·FastQC·정량의 짧은 기초 강의 → PacBio → ONT → DNA decoding