MOLECULAR INFORMATION ENGINEERING 11-3

Single Molecule Sequencing and Roche SBX

단일분자 시퀀싱과 Roche SBX

단일분자 측정의 조건 / PacBio SMRT와 HiFi / Roche Sequencing by Expansion / 단일분자 기술 비교

송영준 Youngjun Song / 인천대학교 / 75분

강의 폴더 강의 안내

클론 신호와 단일분자 신호

클론 기반: 같은 서열의 많은 사본을 함께 측정
단일분자: 한 분자의 반응·통과 신호를 추적
신호 크기, 배경, 시간 분해능의 제약
증폭 없는 검출과 긴 read는 별도 특성

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

Helicos 단일분자 SBS

표면에 단일 DNA 분자 고정
형광 뉴클레오타이드의 단계적 공급
도입 신호의 촬영과 표지 제거
증폭 기반 NGS와 실시간 단일분자 사이의 사례

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18388294/

2.5세대라는 비공식 분류

일부 교육 자료에서 쓰는 중간 분류
단일분자 여부, 증폭 여부, read 길이를 분리
플랫폼의 실제 반응과 검출기로 기술
Roche SBX를 세대 숫자 하나로 단정하지 않음

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

단일분자 검출과 배경 신호

신호 분자와 자유 기질의 공존
형광 관찰 부피의 감소
반응 중 체류 시간과 자유 확산 시간의 차이
전기 검출에서는 이온 전류와 대역폭의 제약

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

SMRT Cell과 ZMW

SMRT: Single Molecule Real Time
Zero-Mode Waveguide의 작은 관찰 공간
바닥에 고정된 polymerase와 주형
자유 기질의 배경을 줄인 형광 관측

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

Zero-Mode Waveguide의 광학

zero-mode의 뜻

원통형 금속 도파관은 차단 파장 λ_c ≈ 1.7 d 보다 긴 빛을 전파시키지 못함 (TE11 모드) → 도파관 안 전파 모드가 0개

계산

d = 70 nm → λ_c ≈ 1.7 × 70 ≈ 119 nm
가시광 400–700 nm ≫ 119 nm → 빛은 들어가지 못하고 입구에서 지수적으로 사라지는 소산파만 남음

결과

바닥 20–30 nm만 밝음 → 관찰 부피 zL(10⁻²¹ L) 수준 · 위쪽 µM 용액은 어둠 속

표면화학

Al 벽은 PVPA로 막고 유리 바닥에만 중합효소 고정 → 구멍당 효소 1개 비율 ≈ 30% (Poisson 한계 e⁻¹ ≈ 37%)

https://doi.org/10.1126/science.1079700

관찰 부피와 평균 분자 수

정의 Definition

관찰 부피 V = 빛이 충분히 들어와 형광을 내게 하는 공간
ZMW 밝은 부분을 원기둥으로 근사: V ≈ π (d/2)² · Λ (d 지름, Λ 소산파 감쇠 길이)
부피 속 평균 분자 수: N = C · V · N_A (C 몰농도, N_A = 6.0×10²³)
단위: 1 fL = 10⁻¹⁵ L · 1 aL = 10⁻¹⁸ L · 1 zL = 10⁻²¹ L
N ≲ 1 이면 형광 펄스 하나 = 분자 하나

예제 Example

d = 70 nm, Λ = 20 nm
V = π × (35×10⁻⁹ m)² × 20×10⁻⁹ m
= 7.7×10⁻²³ m³ = 7.7×10⁻²⁰ L ≈ 77 zL
10 µM: N = 10⁻⁵ × 7.7×10⁻²⁰ × 6.0×10²³ ≈ 0.46개
1 µM: N ≈ 0.05개
공초점 0.5 fL과 비교: 0.5×10⁻¹⁵ ÷ 7.7×10⁻²⁰ ≈ 6,500배 작음
ZMW.pptx 14번: 100 nm ZMW · 0.1–10 µM에서 부피 안 분자 0.01–1개

교육용 관찰 부피 근사 / https://doi.org/10.1126/science.1079700

인산 표지 뉴클레오타이드

형광 표지를 인산 쪽에 연결
중합효소 활성 부위에서 도입 중 신호 관찰
도입 후 표지 부분이 떨어져 확산
새 가닥의 연속 신장

기질의 활성 부위 결합
도입 중 형광 관측
결합 형성과 표지 이탈
다음 기질의 연속 도입

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

SMRTbell 원형 주형

이중가닥 insert 양끝에 hairpin adapter 연결
한 가닥이 원형 경로를 따라 두 방향 반복 판독
Adapter 구간을 제외한 subread 구분
같은 원래 분자의 반복 관측

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

CCS와 HiFi read

CCS: Circular Consensus Sequencing
같은 분자의 여러 관측을 정렬·합의
Polymerase read, subread, HiFi read의 구분
긴 read와 높은 합의 정확도의 결합

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

반복 판독과 consensus의 모형

정의 Definition

한 바퀴에서 한 자리의 오류 확률 p, 바퀴끼리 독립이라 가정
n바퀴(홀수) 다수결이 틀릴 확률:
P_err(n) = Σ_k>n/2 C(n,k) p^k (1−p)^n−k
품질 점수 Q = −10 log₁₀ P · Q20 = 99% · Q30 = 99.9% · Q40 = 99.99%
한계: 같은 자리에서 반복되는 계통 오류(호모폴리머)는 독립 가정이 깨짐 → 다수결로 안 사라짐

예제 Example · p = 0.10

n = 3: 3p²(1−p) + p³ = 0.027 + 0.001 = 0.028 → Q15.5
n = 5: 10p³(1−p)² + 5p⁴(1−p) + p⁵ ≈ 0.0086 → Q20.7
n = 7 → 0.0027 (Q25.6) · n = 9 → 0.00089 (Q30.5) · n = 11 → Q35.3
p = 0.15이면 n = 9 → Q22.5 · n = 15 → Q32
실측 비교: Wenger 2019 “10 passes to achieve Q30” ↔ 모델 n ≈ 9

독립 오류의 다수결 모형 / https://doi.org/10.1038/s41587-019-0217-9

단일 pass와 최종 read 정확도

Raw pass의 오류와 합의 read의 오류
같은 분자를 더 읽는 데 드는 시간
짧은 insert와 긴 insert의 반복 수 차이
제조사 지표의 library·run 조건 확인

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

반응 시간 정보와 변형 염기

형광 색: 염기 종류의 단서
Pulse width와 interpulse duration
염기 문맥과 변형의 반응 속도 영향
훈련된 모형을 이용한 methylation call

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

Vega와 Revio

Vega: benchtop HiFi 플랫폼
Revio: 여러 SMRT Cell의 병렬 운용
공통 원리: ZMW와 반복 판독 consensus
장비 처리량과 실제 샘플 수의 구분

https://www.pacb.com/vega/

PacBio 공식 원리 영상

PacBio (1:29)YouTube에서 보기

영상의 관찰 항목

SMRTbell의 구조
ZMW 안 polymerase의 반응
반복 관측에서 HiFi 생성

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

Roche 기술의 구분

454: 증폭 비드와 pyrosequencing
SBX: 대리 고분자 변환과 nanopore 판독
회사가 같아도 다른 주형·화학·검출
2025년 SBX 공개, 2026년 AXELIOS 1 출시 발표

https://www.roche.com/investors/updates/inv-update-2026-06-29

SBX의 정보 변환

원래 DNA 또는 RNA의 서열 정보
합성 과정에서 Xpandomer 대리 고분자로 부호화
염기 사이의 신호 표지 간격 확대
대리 고분자의 나노포어 전기 판독

서열 정보의 복사
Xpandomer 형성
확장된 표지 배열
Nanopore 전류 판독

https://www.roche.com/media/releases/med-cor-2025-02-20

Xpandomer와 신호 간격

Roche 설명: 원래 분자보다 약 50배 확장
확장된 reporter로 신호 구분
짧은 자연 염기의 공간 간격 문제를 다른 방식으로 처리
확장 배수와 원래 read 길이는 다른 수치

https://www.roche.com/investors/updates/inv-update-2026-06-29

SBX와 native nanopore 비교

ONT: 원래 핵산의 전류 신호와 motor 제어
SBX: 서열을 대리 고분자로 변환 후 판독
공통점: 단일분자·나노포어 전기 신호
차이: 읽는 분자와 앞단의 화학

https://www.roche.com/media/releases/med-cor-2025-02-20

AXELIOS 1 장비와 workflow

Library preparation과 SBX chemistry
다중 nanopore CMOS 센서
전기 신호의 basecalling과 분석
Research Use Only 제품의 공개 자료

https://diagnostics.roche.com/us/en/products/systems/axelios-1-sys-597.html

Roche SBX 공식 기술 영상

Introducing Roche Sequencing by Expansion (SBX) Technology

Roche (3:25)YouTube에서 보기

영상의 관찰 항목

확장 가능한 기질의 반응
대리 고분자의 생성
Nanopore의 전기 신호 검출
SBS와 다른 신호 변환 단계

https://www.roche.com/media/releases/med-cor-2025-02-20

측정 대상에 따른 비교

Helicos: 단일분자·단계적 광학 SBS
PacBio: polymerase의 실시간 형광 반응
ONT: native 핵산의 이온 전류
SBX: 대리 고분자의 나노포어 신호

확인·실습 문제

ONT와 Roche SBX가 모두 나노포어를 쓰면서도 동일한 기술이 아닌 이유

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/

CCS는 RCA 증폭과 다르다

검토·보강 · 2026-10-31

SMRTbell 반복 관측은 같은 분자를 여러 번 읽는 방식이다. RCA는 원형 주형을 복제해 신호 사본을 만드는 방식이다.
PacBio의 native HiFi 라이브러리는 PCR 없이 원래 분자를 읽을 수 있다. 목적별 PCR 라이브러리도 있으므로 “모든 PacBio 실험은 무증폭”으로 확대하지 않는다.
단일분자 consensus는 계통 오류가 남을 수 있어 실제 품질 보정·참조 검증이 필요하다.
공식 현행 설명은 Vega·Revio의 HiFi BAM 출력과 후속 assembly·variant·phasing을 연결한다.

PacBio · How HiFi works

단일분자 시퀀싱 확인 문제

ZMW가 배경 형광을 줄이는 이유
SMRTbell의 반복 판독과 consensus
SBB·SMRT·SBX의 차이
확장 배수와 원본 read 길이 구분

확인·실습 문제

같은 원본을 반복해서 읽는 CCS와 원본 정보를 대리 고분자로 바꾸는 SBX 비교

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/how-it-works/