MOLECULAR INFORMATION ENGINEERING · WEEK 11 · LECTURE 11-1

Sanger Sequencing(생어 시퀀싱)

PCR 밴드에서 크로마토그램까지 — DNA를 한 염기씩 읽는 방법

젤에서 밴드를 찾는 경험에서 출발해 Taq 폴리머라제와 dNTP의 결합을 이해하고, ddNTP가 사슬을 멈추는 원리 · 방사성에서 4색 형광으로 바뀐 검출 · 캐필러리 전기영동 · .ab1 크로마토그램 판독과 트러블슈팅까지

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Learning Objectives(학습 목표)

PCR의 효소·온도 조건에서 생어 시퀀싱의 검출·판독까지

  1. 젤의 밴드 하나에서 출발해 PCR 3단계(변성 · 어닐링 · 신장)를 온도와 효소 조건으로 설명
  2. Taq 폴리머라제가 PCR을 자동화할 수 있었던 이유를 변성 온도와 효소의 열안정성으로 설명
  3. 프라이머 말단의 3′-OH와 들어오는 dNTP의 α-인산 사이 결합 형성을 서술하고, ddNTP의 3′-H가 사슬을 멈추는 이유를 구조로 비교
  4. 방사성 · 인광 검출에서 4색 형광 · 캐필러리 전기영동으로 바뀐 이유를 처리량과 분해능으로 설명
  5. .ab1 크로마토그램에서 믿을 구간과 버릴 구간을 구분하고, 대표적인 문제 패턴의 원인을 추정
오늘의 한 문장

생어 시퀀싱은 "어디서 멈췄는가"를 길이로 바꿔 읽는 기술 — 길이는 전기영동이, 마지막 염기는 색이 알려줌

오늘 다루지 않는 것

Illumina · Nanopore · PacBio 등 차세대 시퀀싱(11-2) · FASTQ 품질과 대량 디코딩(12–13주차) · 본 강의는 한 번에 한 서열을 읽는 방식만

Lecture Map

밴드 → 효소 → 멈춤 → 검출 → 판독

PART 1
PCR — 밴드에서 출발젤 전기영동 · Taq
변성 · dNTP 채택 · 약 20분
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PART 2
사슬 종결ddNTP의 3′-H
조각 사다리 · 사이클 시퀀싱
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PART 3
검출의 진화방사성 · 인광 → 4색 형광
캐필러리 전기영동
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PART 4
.ab1 판독크로마토그램 · 품질값
실행 · 트러블슈팅
  • PCR을 먼저 이해해야 함 — 생어 반응은 프라이머 1개짜리 PCR에 멈춤 장치를 넣은 것
  • 각 단계는 무엇이 들어가고 · 무엇이 바뀌고 · 무엇이 남는지의 세 질문으로 고정해 서술
  • 마지막 PART는 그림 중심 — 실제 트레이스를 보며 좋은 피크와 나쁜 피크를 구분하는 눈을 만듦
앞 주차와의 연결

10주차 Random Access의 선택적 PCR이 오늘 PART 1의 출발점 · 4주차에서 배운 치환 · 삽입 · 삭제 오류가 PART 4 크로마토그램에서 실제 모양으로 나타남

복습 — DNA 데이터 저장의 읽기 단계

저장 워크플로에서 시퀀싱 단계의 위치

① 인코딩디지털 → 염기서열
3주차
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② 합성서열 → 실제 DNA
6 · 7주차
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③ 보관건조 · 캡슐화
9주차
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④ 접근선택적 PCR
10주차
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⑤ 시퀀싱DNA → 서열
11주차 오늘
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⑥ 디코딩서열 → 디지털
12주차
왜 생어부터 배우는가

대량 처리에는 NGS를 쓰지만, 정확도의 기준(gold standard)은 여전히 생어 · 플라스미드 확인 · 변이 검증 · 합성 올리고 품질 확인에 매일 쓰임

오류의 물리적 기원

4주차의 치환 · 삽입 · 삭제가 "읽기" 단계에서도 생김 — 크로마토그램의 이중 피크 · 미끄러짐 · 신호 소실이 그 모습

11주차의 구성

11-1(오늘) Sanger — PCR · 사슬 종결 · 검출 · 크로마토그램
11-2 게놈 조립 · 인류사 · NGS
11-3~11-6 단일분자 · 나노포어 · FASTQ 품질

오늘의 출발 질문

젤 위의 밴드 하나 — 그것은 어떻게 만들어졌고, 그 안의 서열은 어떻게 읽는가

PART 1

PCR — 밴드에서 출발

Polymerase Chain Reaction(중합효소 연쇄 반응) · 약 20분

  • 젤 위의 밴드를 먼저 보고, 그 밴드가 만들어진 과정을 거꾸로 따라감
  • 폴리머라제가 필요로 하는 네 가지 — 주형 · 프라이머 · dNTP · Mg²⁺
  • 고온에서 죽지 않는 효소 Taq — 변성이 꼭 필요하기 때문
  • dNTP가 주형에 맞춰 하나씩 붙는 모양과 결합

출발 질문 — 이 밴드는 어디서 왔나

PCR이 끝난 튜브를 젤에 걸었을 때 보이는 것

M 1 2 1000 700 500 400 300 200 100 bp ( − ) 웰 → 이동 방향 ↓ → ( + )
M: 크기 표준(ladder) · 1: PCR 산물 · 2: 음성 대조군(NTC, 주형 없음) · 모식도
관찰

1번 레인에 약 500 bp 위치에 밴드 하나 · 2번 레인은 비어 있음

  • 보이지 않는 분자 수십억 개가 같은 길이로 모여야 밴드 하나가 보임
  • 주형이 없는 2번에 밴드가 없다는 것 — 밴드는 주형에서 복사된 것
  • 그렇다면 질문 세 가지: 누가 복사했나 · 왜 정확히 500 bp인가 · 어떻게 이렇게 많아졌나
오늘의 순서

젤이 어떻게 크기를 알려주는지 → 복사하는 효소 → 복사 조건 → 증폭 → 다시 젤

교육용 젤 모식도 · 연구실 실측 사진으로 오인하지 않기

Gel Electrophoresis(젤 전기영동) — 크기로 줄 세우기

DNA는 모두 음전하 · 아가로스 그물은 체 · 작은 조각이 먼저 도착

완충액 (TAE · TBE) 웰 − + 음극양극 큰 조각작은 조각 인산 골격의 음전하 → 양극 쪽으로 이동 그물 속 — 작은 조각(파랑) 빠름 · 큰 조각(빨강) 느림 log(bp) 이동 거리 →표준곡선 — log(크기)가 거리에 따라 직선으로 감소
자체 제작 모식도 · 이동 거리와 크기의 반로그 관계(표준곡선)
  • 전하는 길이에 비례 — 염기마다 인산 1개 · 전하/질량 비가 거의 일정 → 분리 기준은 오직 크기
  • 아가로스 0.8–2% — 농도가 높을수록 그물이 촘촘해져 작은 조각을 잘 나눔 · 1–2염기 차이는 폴리아크릴아마이드(PAGE)에서 구분
  • 크기 읽기 — 같은 젤에 건 ladder와 위치를 비교 · 반로그 표준곡선에서 보간
  • 보이게 하기 — DNA 사이에 끼어드는 형광 염색약(SYBR Safe · GelRed · EtBr) + 청색광/UV
PART 3와의 연결

같은 원리를 가는 관(캐필러리)과 폴리머 용액으로 바꾸면 1염기 차이까지 나뉨 — 생어 시퀀싱의 검출 장치

DNA Polymerase(폴리머라제) — 복사에 필요한 네 가지

폴리머라제는 새로 시작하지 못함 · 이미 있는 3′-OH 끝에만 이어 붙임

3′5′ TACGG ATCACTG ATGCC 5′ 3′-OH 프라이머 (짧은 DNA) 폴리머라제 T PPP 들어오는 dTTP 5′ → 3′ 방향으로만 신장 주형 가닥 (읽히는 쪽) — 프라이머 다음 자리 A의 짝은 T → dTTP가 들어옴
자체 제작 모식도 · 주형은 3′→5′로 읽히고 새 가닥은 5′→3′로 자람

① Template(주형)

읽을 가닥 · 단일가닥이어야 염기가 노출됨 → 변성이 필요한 이유

② Primer(프라이머)

18–25 nt 짧은 DNA · 폴리머라제에게 3′-OH 시작점을 제공 · 어디부터 복사할지 결정

③ dNTP 4종

dATP · dCTP · dGTP · dTTP · 재료이자 에너지원 (삼인산)

④ Mg²⁺

활성 부위에서 인산의 음전하를 안정화 · 보통 1.5–2.5 mM · 너무 많으면 비특이 증폭

Taq Polymerase(택 폴리머라제) — 온천에서 온 효소

Thermus aquaticus — 약 70 °C 온천에 사는 세균의 DNA 폴리머라제

연도사건
1969옐로스톤 온천에서 T. aquaticus 분리 보고 (Brock & Freeze)
1976이 세균에서 DNA 폴리머라제 정제 (Chien, Edgar, Trela)
1983Kary Mullis, PCR 개념 고안 — 처음엔 대장균 효소(Klenow) 사용
1988Taq를 PCR에 도입 · 자동 온도 순환 가능해짐 (Saiki 외, Science)
1993Mullis 노벨 화학상

다음 슬라이드: Brock·Mullis 실제 사진과 연구 기여

성질대략값 (조건 의존)의미
최적 온도72–80 °C신장 단계를 72 °C로 두는 이유
95 °C 반감기약 40분30사이클 변성을 버팀
신장 속도약 1 kb/분"1분/kb" 규칙
교정(3′→5′ 엑소)없음오류율 약 10⁻⁴–10⁻⁵/nt
3′ 말단A 하나 추가TA 클로닝에 이용
교정 기능이 없다는 것

정확한 복사가 중요하면 Pfu · Q5 같은 교정 효소를 씀 · 반면 PART 2의 시퀀싱용 효소는 Taq 계열을 개량한 것 — ddNTP를 잘 받아들이도록

Brock TD & Freeze H, J Bacteriol 98:289 (1969) · Chien A et al., J Bacteriol 127:1550 (1976) · Saiki RK et al., Science 239:487 (1988) · 수치는 제조사·조건에 따라 다름

온천의 미생물에서 PCR 자동화로

Thomas D. Brock
Thomas D. Brock
Brock & Freeze (1969)
T. aquaticus 분리 보고UW–Madison · 대학 사진 인용
Kary Mullis
Kary Mullis
1983 PCR 아이디어
1993 노벨 화학상Dona Mapston · CC BY-SA 3.0
역할을 구분하기

Brock: 고온성 미생물 · Chien·Edgar·Trela: Taq 효소 정제(1976) · Mullis: PCR 발상 · Saiki 등: 내열 효소를 이용한 PCR(1988).

Saiki et al., Science (1988) · UW–Madison, Brock

왜 고온에서 안 죽는 효소가 필요한가

매 사이클 95 °C로 가닥을 풀어야 함 → 보통 효소는 그때마다 변성되어 죽음

효소 활성 12345 사이클 (각 사이클 시작에 95 °C 변성) 95 °C Taq — 한 번 넣으면 끝까지 대장균 효소 — 매번 죽고, ● 다시 넣음
자체 제작 개념도 · 실제 Taq도 서서히 활성을 잃음 (95 °C 반감기 수십 분)
Taq 이전 (1985)Taq 이후 (1988~)
효소대장균 KlenowTaq
효소 추가매 사이클 손으로처음 한 번
장비온도 다른 수조 3개 사이를 옮김자동 Thermal cycler
어닐링·신장 온도37 °C 근처 — 프라이머가 엉뚱한 곳에도 붙음55–72 °C — 특이성 향상
숨은 장점 — 특이성

높은 온도에서는 프라이머가 완벽히 맞는 자리에만 남음 → 젤에 밴드 하나

Hot-start

실온 셋업 중의 약한 활성 → 프라이머 다이머 · 그래서 첫 95 °C 전까지 잠가 둔 효소가 표준

Saiki RK et al., Science 230:1350 (1985) · Saiki RK et al., Science 239:487 (1988)

Denaturation(변성) — 이중가닥을 푸는 이유와 온도

염기는 이중나선 안쪽에 숨어 있음 · 풀어야 프라이머와 dNTP가 읽을 수 있음

상온 · 이중가닥 GC AT CG TA GC 94–98 °C 수소결합 끊김 단일가닥 2개 GACTG CTGAC 염기가 노출됨
자체 제작 모식도 · A–T 수소결합 2개, G–C 3개 (점선)
  • Tm(녹는점) — 이중가닥의 절반이 풀리는 온도 · GC가 많을수록, 길수록 높음
  • G–C는 수소결합 3개 + 더 강한 염기 쌓임(stacking) → A–T보다 단단함
  • PCR은 Tm보다 충분히 높은 94–98 °C로 수십 초 · 첫 사이클은 2–3분 (긴 주형·플라스미드를 완전히 풀기 위해)
Tm ≈ 2(A+T) + 4(G+C) 짧은 프라이머(≈20 nt 이하)의 어림 · Wallace 규칙
칠판 계산

20-mer, GC 50% → 2×10 + 4×10 = 60 °C · 어닐링은 보통 Tm보다 3–5 °C 낮게 시작

변성 → 효소 사망 → Taq

변성은 생략할 수 없는 단계 · 그래서 효소가 그 온도를 견뎌야 함 — 앞 장의 결론과 연결

PCR 한 사이클 — 변성 · 어닐링 · 신장

그림을 클릭하며 한 단계씩 · 온도가 바뀔 때마다 무엇이 일어나는지

PCR 1 사이클

5′3′3′5′ 늘리고 싶은 구간 (두 프라이머 자리 사이) 5′3′3′5′ 정방향 프라이머 역방향 프라이머 Taq Taq 새 가닥 (초록) — 5′→3′ 방향 상온 95 °C 55–60 °C 72 °C

교재로 대조 — PCR의 세 단계

Lehninger 그림 8-33 PCR 사이클
Fig. 8-33 · p.301
  • 가열: 주형 두 가닥 분리
  • 어닐링: 서로 다른 두 프라이머가 양 끝을 지정
  • 신장: 각 프라이머의 3′-OH에서 5′→3′ 합성
  • 다음 사이클부터 새 가닥도 주형이 되어 목표 구간이 축적

Nelson & Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 7th ed. (2017), W. H. Freeman · 교재 그림 인용

온도 프로그램 — 실제로 기계에 넣는 값

Thermal cycler(써멀 사이클러) 화면에 입력하는 표준 3단계 프로그램

9572584 온도 (°C) … × 25–35 사이클 초기 변성 2–3분 변성 30 s 어닐링 30 s 신장 1분/kb 최종 신장 5분 4 °C 보관 시간 → (총 1–2시간)
자체 제작 · 일반적인 Taq 조건 예시 · 효소 제조사 권장값 우선
단계온도시간
초기 변성95 °C2–3 min
변성95 °C30 s
어닐링Tm − 530 s
신장72 °C1 min/kb
최종 신장72 °C5 min
보관4 °C∞
어닐링 온도가 핵심 손잡이

너무 낮으면 엉뚱한 곳에도 붙어 여러 밴드 · 너무 높으면 아예 안 붙어 밴드 없음 → 온도 구배(gradient)로 최적값 찾기

dNTP의 구조 — 재료이자 에너지

deoxynucleoside triphosphate(디옥시뉴클레오사이드 삼인산) = 염기 + 디옥시리보스 + 인산 3개

dNTP · 2′-H / 3′-OH OCH₂ PPPOOOOOOO⁻O⁻O⁻⁻Oγβα 염기 N9 / N11′2′3′4′5′ OHH5′-O–Pα–O–Pβ–O–Pγα: 당에 가장 가까운 인산 연결 관계를 보이는 평면 도식 · 입체 배치 및 양성자화 상태 일부 생략
자체 제작 모식도 · 탄소 번호 1′–5′ · α 인산이 당에 가장 가까움
  • 3′-OH — 사슬에 들어간 뒤 다음 dNTP를 받을 손잡이 · PART 2에서 이것을 없앤 것이 ddNTP
  • α-인산만 사슬에 남고 β·γ는 피로인산(PPi)으로 떨어져 나감
  • α–β 사이의 P–O 결합이 끊어져 β·γ가 PPi로 나감 · 방출된 PPi의 가수분해가 순방향 반응을 도움
  • 2′-H — 리보스의 2′-OH가 없음 = "디옥시" · RNA와의 차이(6주차 복습)
PCR 튜브에 들어가는 양

dATP · dCTP · dGTP · dTTP 각각 보통 0.2 mM · 네 종류 농도가 다르면 오류율이 올라감

dNTP 채택 — 모양이 맞아야 들어감

주형 염기와 짝이 맞는 dNTP만 활성 부위에 "딱 맞게" 들어감

A = T (수소결합 2개) A 퓨린 (고리 2개) T 피리미딘 (고리 1개) G ≡ C (수소결합 3개) G C 두 쌍의 폭이 같음 (C1′–C1′ 약 10.5 Å) G · T 불일치 G T 수소결합 자리 · 각도가 어긋남 폴리머라제의 검사 맞는 짝 → 손가락 도메인이 닫힘 → 결합 틀린 짝 → 닫히지 않음 → 빠져나감 (induced fit · 유도 적합)
자체 제작 모식도 · 실제 원자 배치는 생략
  • A는 T와, G는 C와 — 수소결합을 주고받는 자리가 맞물리는 조합
  • 퓨린 + 피리미딘 = 항상 같은 폭 → 이중나선의 지름이 일정 · 폴리머라제는 이 "정해진 폭"을 자처럼 씀
  • 틀린 짝도 가끔 들어감 → Taq의 오류율 약 1만–10만 염기에 1개
한 문장으로

폴리머라제는 염기를 "읽는" 것이 아니라 짝의 모양이 표준과 같은지를 확인함

PART 2 예고

ddNTP도 염기 모양은 정상 → 폴리머라제가 정상 재료로 착각하고 받아들임 · 차이는 반대편 3′ 끝에 있음

교재로 대조 — 손가락 도메인과 염기쌍 기하

활성 부위는 단순한 자가 아니다 · 기하, 수소 결합, 유도 적합과 반응 화학이 함께 작용

DNA 중합효소 활성 부위와 palm fingers thumb
Fig. 25-5 · p.992
정상 염기쌍과 오짝 염기쌍의 활성 부위 적합성
Fig. 25-6 · p.993

Nelson & Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 7th ed. (2017), W. H. Freeman · 교재 그림 인용

결합 형성 — 3′-OH가 α-인산을 공격

한 염기가 붙는 순간의 화학 · 그림을 클릭하며 단계별로

뉴클레오타이드 한 개의 도입

3′5′ TGTA 주형 당 프라이머 끝 (C) 3′-OH Pα Pβ Pγ 당 A 들어온 dATP Mg Mg P P P PPi 새 3′-OH → 다음 반응점

두 금속 이온 메커니즘: Steitz TA, J Biol Chem 274:17395 (1999) · 자체 제작 모식도 · 원자 배치 단순화

지수 증폭 — 몇 사이클이면 보이나

사이클마다 두 배 · 30사이클이면 약 10억 배

10⁰10³10⁶10⁹10¹² 010203040 사이클 수 이상적 2ⁿ 실제 — 정체기(plateau) 젤에서 보이기 시작하는 대략의 양 (~10¹⁰ 분자)
자체 제작 개념도 · 출발량 1 복제 가정 · 실제 시료는 보통 수천–수십만 복제에서 시작해 더 일찍 보임
N = N₀ · (1 + E)ⁿ E: 사이클 효율 (이상적이면 1)
칠판 계산

2³⁰ = 1,073,741,824 ≈ 10⁹ · 효율 90%면 1.9³⁰ ≈ 2×10⁸

  • 정확한 길이의 산물은 3번째 사이클에 처음 나타남 — 두 프라이머 사이만 남은 가닥 · 이후 이 산물이 지배
  • 정체기 — 프라이머·dNTP 소진, 효소 활성 감소, 산물끼리 다시 붙음 → 사이클을 늘려도 더 안 늘고 비특이 산물만 증가
  • 정량이 필요하면 정체기 전 구간을 실시간으로 봄 → qPCR (10주차 연결)

다시 젤로 — 밴드 해석과 PCR 트러블슈팅

생어 시퀀싱에 보내기 전, PCR 산물이 깨끗한지 젤에서 먼저 확인

M 1 2 3 4 5 6 7 1000 700 500 400 300 200 100 bp ( − ) 웰 → 이동 방향 ↓ → ( + )
자체 제작 모식도 · 레인 번호는 오른쪽 표와 대응
레인모습흔한 원인대처
1밴드 하나정상정제 후 시퀀싱
2NTC 깨끗오염 없음—
3NTC에 밴드시약·피펫 오염시약 교체 · 공간 분리
450 bp 근처 흐린 밴드프라이머 다이머프라이머 재설계 · hot-start
5여러 밴드어닐링 온도 낮음온도 ↑ · 구배 PCR
6번짐(smear)주형·사이클 과다주형 ↓ · 사이클 ↓
7밴드 없음어닐링 높음 · 억제제온도 ↓ · 주형 정제
생어로 넘어가기 전 조건

밴드가 하나여야 함 · 여러 밴드를 그대로 보내면 PART 4의 "처음부터 이중 피크" 크로마토그램이 나옴 · 남은 프라이머와 dNTP는 효소 처리(ExoSAP)나 컬럼으로 제거

퀴즈 1 — PCR

문항을 선택하면 해답 표시

Taq 대신 대장균 폴리머라제를 한 번만 넣고 30사이클을 돌리면 젤에 무엇이 보이나
거의 아무것도 보이지 않음 · 첫 95 °C 변성에서 효소가 변성되어 이후 사이클에 신장이 일어나지 않음 → 증폭이 1회 이하에서 멈춤
어닐링 온도를 Tm보다 15 °C 낮게 잡으면 젤은 어떻게 바뀌나
원하는 밴드 외에 여러 밴드나 번짐이 생김 · 프라이머가 부분적으로만 맞는 자리에도 붙어 있다가 신장되기 때문
dNTP 중 dGTP만 빠뜨리면 어떤 일이 일어나나
주형에서 C를 만나는 첫 자리에서 신장이 멈춤 · 짝이 맞는 재료가 없으므로 · PART 2 사슬 종결과 비교: 이쪽은 "재료가 없어서", 생어는 "재료가 멈춤 장치를 달고 와서"
효율 100%로 25사이클과 35사이클의 산물 양 차이는 몇 배인가 · 실제로도 그런가
이론상 2¹⁰ ≈ 1,000배 · 실제는 정체기 때문에 차이가 훨씬 작고, 35사이클 쪽은 비특이 산물·번짐이 늘어남
PART 2

사슬 종결 — ddNTP

Chain Termination(체인 터미네이션) · 1977

  • PART 1의 신장 반응에 "멈춤 장치"를 섞는다는 생각
  • ddNTP — 3′-OH 하나를 지운 dNTP
  • 모든 위치에서 한 번씩 멈춘 조각들의 사다리
  • 사이클 시퀀싱 — 프라이머 1개짜리 PCR

생어의 아이디어 — 멈춘 위치가 곧 서열

"G에서만 멈추는 반응"을 만들면, 조각 길이들이 곧 G의 위치 목록

핵심 논리

신장을 무작위로, 하지만 특정 염기에서만 멈추게 함 → 길이를 재면 그 염기가 몇 번째에 있는지 알 수 있음 → 네 염기 모두 하면 전체 서열

연도사건
1977Sanger · Nicklen · Coulson, ddNTP 사슬 종결법 발표 (PNAS)
1977Maxam–Gilbert 화학 절단법 — 같은 해, 독성 시약 탓에 생어법에 밀림
1980Sanger 두 번째 노벨 화학상 (Gilbert · Berg와 공동)
1986–87형광 표지 · 자동 시퀀서 (PART 3)
2003인간 게놈 프로젝트 완료 — 주력 기술이 캐필러리 생어
새로 만들 가닥 (모름) AGCTGAAGT 123456789 "G에서 멈춤" 반응의 산물 2 nt 5 nt 8 nt 파랑: 프라이머 · 회색: 정상 신장 · 검정: G에서 종결 길이 2 · 5 · 8 → G는 2, 5, 8번째 A · C · T 반응도 같은 방식 → 9개 위치 모두 결정
자체 제작 개념도

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR, PNAS 74:5463 (1977) · Maxam AM & Gilbert W, PNAS 74:560 (1977)

생어 방법을 만든 사람들

Frederick Sanger
Frederick Sanger
1958: 인슐린 구조 · 1980: 핵산 서열
1977: 사슬 종결법NLM/NIH · Public domain
Walter Gilbert
Walter Gilbert
1980 노벨 화학상
Maxam–Gilbert 화학 절단법NLM/NIH · Public domain
Alan Coulson
Alan Coulson
Sanger·Nicklen·Coulson (1977)
실험 기술과 후속 게놈 지도Barry Honda / Wellcome · CC BY-NC
공동 연구의 기록

1977년 사슬 종결 논문의 저자는 Frederick Sanger, Steve Nicklen, Alan R. Coulson이다. Gilbert의 방법은 다른 원리의 동시대 기술이다.

Sanger et al., PNAS (1977) · Nobel Prize 1980

ddNTP — 3′-OH 하나의 차이

dideoxy(다이디옥시) = 2′과 3′ 두 자리 모두 산소가 없음

dNTP · 2′-H / 3′-OH OCH₂ PPPOOOOOOO⁻O⁻O⁻⁻Oγβα 염기 N9 / N11′2′3′4′5′ OHH5′-O–Pα–O–Pβ–O–Pγα: 당에 가장 가까운 인산 연결 관계를 보이는 평면 도식 · 입체 배치 및 양성자화 상태 일부 생략
3′-OH 있음 → 다음 dNTP의 α-인산을 공격할 수 있음 → 계속 신장
ddNTP · 2′-H / 3′-H OCH₂ PPPOOOOOOO⁻O⁻O⁻⁻Oγβα 염기 N9 / N11′2′3′4′5′ HH5′-O–Pα–O–Pβ–O–Pγα: 당에 가장 가까운 인산 연결 관계를 보이는 평면 도식 · 입체 배치 및 양성자화 상태 일부 생략
3′-H → 공격할 산소가 없음 → 들어간 자리에서 영구 정지
왜 폴리머라제가 받아들이나

염기 · 삼인산 · α-인산 쪽은 정상과 같음 → 짝 맞추기와 결합 형성(PART 1)은 그대로 일어남 · 문제는 그 다음 차례에 생김

6주차와 비교

화학 합성에서는 캡핑이 실패한 사슬을 인위적으로 멈춤 · 생어에서는 멈춤이 의도된 정보 — 멈춘 위치가 곧 데이터

교재로 대조 — ddNTP 구조와 생어 방법

생어 사슬 종결과 ddNTP 구조 및 4레인 젤
Fig. 8-34 · p.303
  • 2′-H: DNA의 디옥시 당
  • 3′-H: 다음 결합을 만들 3′ 산소가 없음
  • ddNTP 자체의 편입은 프라이머 말단의 3′-OH가 수행
  • 편입된 ddNMP가 새 말단이 된 뒤 다음 반응이 막힘
  • α 인산은 사슬에 남고 β·γ 인산은 PPi로 떨어짐

Nelson & Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 7th ed. (2017), W. H. Freeman · 교재 그림 인용

사슬 종결 — 단계별로 보기

dNTP 사이에 ddNTP가 소량 섞인 튜브 안에서 한 분자에 일어나는 일

한 분자의 운명

3′5′ TAGCATCG 프라이머 ATC G ddG H T 결합 불가 — 영구 정지 dNTP ●●●●●●●● ddNTP ○

조각 사다리 — 모든 위치에서 한 번씩

수십억 분자가 각자 다른 곳에서 멈춤 → 길이가 1 nt씩 다른 조각 세트(nested set)

프라이머 G +1 A +2 T +3 C +4 A +5 G +6 T +7 T +8 A +9 C +10 짧은 것부터마지막 색 읽기 읽은 서열 5′– G A T C A G T T A C –3′
자체 제작 · 4색 염료 종결자 방식 기준 · 마지막 칸 색 = 종결한 ddNTP
읽는 방법

짧은 조각부터 차례로 마지막 색만 읽으면 새 가닥의 서열(5′→3′) · 주형은 그 상보 서열

ddNTP : dNTP 비율

ddNTP를 많이 넣으면 짧은 조각 위주 → 앞부분만 강하고 뒤가 약함 · 적게 넣으면 긴 조각 위주 → 앞부분 신호가 약함 · 상용 키트는 약 1 kb를 고르게 읽도록 최적화되어 있음

프라이머 바로 뒤가 안 읽히는 이유 (PART 4 예고)

가장 짧은 조각들은 프라이머와 함께 나오는 잔여물 · 미반응 염료와 겹쳐 처음 수십 염기는 신뢰도가 낮음

Cycle Sequencing(사이클 시퀀싱) — 프라이머 1개짜리 PCR

PART 1과 같은 기계 · 같은 온도 순환 · 다른 점은 프라이머 수와 ddNTP

PCR사이클 시퀀싱
프라이머2개 (정방향 · 역방향)1개
증폭지수 (2ⁿ)선형 — 매 사이클 주형에서 새로 복사
재료dNTPdNTP + 형광 ddNTP
산물같은 길이의 이중가닥길이가 다른 단일가닥 조각 세트
주형게놈 · cDNA 등정제된 PCR 산물 · 플라스미드
효소Taq · 교정 효소ddNTP를 잘 받도록 개량한 Taq
사전 정리 필수

PCR에서 남은 프라이머 2개와 dNTP가 들어오면 두 방향에서 동시에 신장 → 겹친 신호 · ExoSAP나 컬럼으로 제거

96 °C 1 min → [ 96 °C 10 s · 50 °C 5 s · 60 °C 4 min ] × 25 → 4 °CBigDye 계열 표준 예시
신장 60 °C · 4분

1 kb 가까운 조각까지 충분히 자라도록 길게 · 온도·시간은 키트 제조사 권장값을 그대로 사용

효소 개량 — F667Y

야생형 Taq는 ddNTP를 dNTP보다 훨씬 덜 받아들여 피크 높이가 들쭉날쭉 · 667번 페닐알라닌 → 티로신 치환 하나로 ddNTP 구별이 크게 줄어 고른 피크 높이

Tabor S & Richardson CC, PNAS 92:6339 (1995) · 온도 조건은 Thermo Fisher BigDye Terminator v3.1 사용자 안내서 기준 예시 · 실제 값은 키트 문서 확인

PART 3

검출 — 방사성에서 4색 형광으로

Detection(검출) · Capillary Electrophoresis(캐필러리 전기영동)

  • 1세대: 방사성 표지 · 4개 레인 · X선 필름과 인광판
  • 인광과 형광 — 빛을 내는 시간의 차이
  • 2세대: 4색 형광 염료 · 한 레인에서 네 염기 동시에
  • 캐필러리 전기영동 · 신호에서 염기와 품질값까지

1세대 — 방사성 표지와 4레인 젤

반응 4개 (ddA · ddC · ddG · ddT) → 레인 4개 · ³²P/³⁵S로 표지 → 필름에 감광

ddA ddC ddG ddT G A T C A G T T A C 아래 → 위로 읽기 아래 = 짧은 조각 = 5′ 쪽 (−) 웰은 위쪽 5′-GATCAGTTAC-3′
자체 제작 모식도 · 아래(짧은 조각)에서 위로 읽음
  • 각 튜브에 한 종류의 ddNTP만 넣음 · 표지는 방사성 dNTP(³⁵S-dATP 등)나 방사성 프라이머
  • 얇고 긴 폴리아크릴아마이드 슬랩 젤 · 수천 V · 1 nt 차이 분리
  • 젤을 말려 X선 필름에 하룻밤–며칠 감광(자동방사선사진) → 사람이 눈으로 읽음
  • 이후 인광판(storage phosphor screen)이 필름을 대신함 — 다음 장
한계

방사선 안전 관리 · 한 샘플에 레인 4개 · 레인끼리 이동 속도 차이 · 사람이 읽는 속도 — 하루 수백 염기 수준

다음 슬라이드에서 1977년 원논문의 실제 젤과 반응 조건을 비교

1977년 원논문 — 필름에서 읽은 염기서열

Sanger 1977 Fig.1 자동방사선사진과 G A T C 레인
Fig.1 · p.5464 · 논문 원본의 이미지 영역 발췌
  • 짧은 조각이 아래로 이동 → 아래에서 위로 새 가닥 판독
  • 레인 순서는 원문에 적힌 G · A · T · C를 따른다
  • 1977년 이 그림의 C 반응에는 araCTP가 사용됨
  • 현대의 네 ddNTP 방식 설명과 역사적 원문의 조건을 구분
  • 자체 제작한 단순 젤 모식도와 실제 실험 이미지를 비교

Sanger, Nicklen & Coulson, PNAS 74:5463–5467 (1977), Fig.1

Phosphorescence(인광) vs Fluorescence(형광) — 빛을 내는 시간

둘 다 빛을 흡수한 뒤 다시 내놓음 · 차이는 거쳐 가는 상태와 걸리는 시간

S₀S₁T₁ 흡수 형광 ns (10⁻⁹ s) 계간전이 인광 µs – 수 초 S: 단일항 상태 · T: 삼중항 상태 (스핀이 뒤집혀 돌아오기 "금지" → 느림)
자체 제작 자블론스키 다이어그램 · 6주차 DMT⁺ 흡수 그림과 같은 틀
형광인광
경로S₁ → S₀S₁ → T₁ → S₀
지속 시간나노초 — 불 끄면 즉시 꺼짐마이크로초–초 — 잔광
시퀀싱에서2세대 염료 · 레이저로 실시간 검출1세대 인광판에서 신호 저장·판독
인광판(storage phosphor screen)

방사선 에너지를 결정 속 전자 갇힘으로 저장 → 나중에 레이저로 훑으면 갇힌 에너지가 빛으로 나옴(광자극 발광) · 필름보다 넓은 동적 범위 · 재사용 가능 — 엄밀히는 고전적 인광과 기전이 다르지만 현장에서 "인광 이미징"이라 부름

형광으로 넘어간 이유

방사선 없이 · 실시간으로 · 색을 나눠 한 레인에 네 염기를 동시에 — 다음 장

2세대 — 4색 형광 표지

형광 프라이머(1986) → 형광 종결자(1987) · 한 레인에서 네 색을 검출

Dye-primer(염료 프라이머) · 1986 ddA 튜브 — 초록 염료 프라이머 ddC 튜브 — 파랑 ddG 튜브 — 노랑(표시는 검정) ddT 튜브 — 빨강 반응은 4개 · 끝나고 섞어서 한 레인에 로딩 Dye-terminator(염료 종결자) · 현재 표준 염료가 ddNTP에 붙어 있음 → 멈춘 바로 그 염기가 색을 가짐 → 튜브 1개 · 프라이머 표지 불필요
자체 제작 모식도 · 색은 크로마토그램 표시 관례
염기표시 색 (관례)
A초록
C파랑
G검정 — 실제 방출은 노랑 계열
T빨강
에너지 전달 염료 (BigDye 계열)

하나의 공여체 염료가 레이저 빛을 받아 네 종류의 수용체 염료로 에너지를 넘김 → 레이저 하나로 네 색을 모두 밝게 들뜨게 함

대가

큰 염료가 조각의 이동 속도를 바꿈 · 미반응 염료 종결자가 남으면 덩어리 신호(dye blob) — PART 4

Smith LM et al., Nature 321:674 (1986) · Prober JM et al., Science 238:336 (1987) · Rosenblum BB et al., Nucleic Acids Res 25:4500 (1997)

형광 자동화 — Hood와 Smith 연구진

Leroy E. Hood
Leroy E. Hood
Smith 등과 형광 DNA 자동 판독(1986)Rajasekhar1961 · CC BY 4.0
두 세대를 혼동하지 않기

여기서 1·2세대는 생어 검출 방식의 구분이다. 다음 11-2의 2세대 NGS는 대량 병렬 플랫폼을 뜻한다.

  • 1986 Smith 논문: 네 종류의 형광 프라이머
  • 반응은 네 개 → 섞어서 한 젤 튜브에 전기영동
  • 1987 Prober 논문: 형광 ddNTP를 쓰는 dye-terminator
  • 기존 그림의 표시색은 현재 관례이며 당시 염료 색과 구분

Smith et al., Nature 321:674–679 (1986) · Prober et al., Science (1987)

1986년 원논문 — 네 형광 채널을 서열로

Smith 1986 Fig.4c의 네 채널 실측 형광 트레이스
Fig.4c · p.677 · ©1986 Nature Publishing Group · 원문 발췌
  • FITC–A, NBD–T, TM–G, Texas Red–C
  • 한 젤 튜브의 혼합 시료를 파장별로 측정
  • 채널마다 피크 위치를 나란히 놓아 염기 호출
  • 그림은 실측 데이터의 확대 구간이며 자체 모의 트레이스와 구분
  • 색 이름과 화면 표시 관례를 동일시하지 않기

Smith et al., Nature 321:674–679 (1986), Fig.4c · USPTO 공개 특허 심판 첨부 원문에서 확인

스펙트럼 겹침과 분광 보정

네 염료의 방출 스펙트럼은 서로 겹침 → 검출기는 "섞인 빛"을 받음 → 수학으로 분리

500550600650nm 방출 세기 회색 띠: 검출 파장 구간 — 각 구간에 두세 염료 빛이 함께 들어옴
자체 제작 개념도 · 염료별 방출 위치는 예시 · 선 색은 표시 관례 색
측정값(구간별) = M × 염료 양 → 염료 양 = M⁻¹ × 측정값M: 분광 보정 행렬
  • Spectral calibration(분광 보정) — 염료 하나씩만 든 표준 시료를 돌려 행렬 M을 기기마다 측정
  • 보정이 틀어지면 한 염료의 신호가 다른 색에 새어 들어가 모든 피크 밑에 작은 "그림자 피크"가 생김 — PART 4에서 이중 피크와 혼동 주의
  • Mobility correction(이동도 보정) — 염료마다 조각을 다르게 끌어 생기는 위치 차이를 소프트웨어가 맞춤 · 키트 · 폴리머 · 기기 조합별 파일로 관리
정리

크로마토그램은 측정된 원본이 아니라 계산된 결과 · 원본(raw)과 처리본(analyzed)이 .ab1 안에 함께 들어 있음

Capillary Electrophoresis(캐필러리 전기영동) 장치

머리카락 굵기의 유리관 + 고분자 용액 체 + 레이저 검출 창

시료 플레이트 (96웰) − 캐필러리 — 내경 약 50 µm · 길이 36–50 cm 안은 고분자 용액(POP-7 등)으로 채움 = 체 DNA 이동 검출 창 레이저 분광기 + CCD 파장별로 동시 측정 양극 완충액 + 전압 수 kV–15 kV · 짧은 조각부터 차례로 검출 창을 지나감
자체 제작 모식도 · 수치는 기종·모드에 따라 다름
  1. 주입 — 캐필러리 끝을 시료에 담그고 수 초간 전압 (전기동역학 주입) · 시료 속 염(salt)이 많으면 DNA 대신 염이 들어감
  2. 분리 — 고분자 체 속에서 크기 순 이동 · 50 °C 근처로 가열해 2차 구조를 풂
  3. 검출 — 창을 지나는 순간 레이저 여기 → 네 색 세기를 시간에 따라 기록
캐필러리 전기영동 검출 장치
기존 Gene_Seq.pptx 51번 · Richard Mathies 장치 도해 · 교재 출처 인용

슬랩 젤에서 캐필러리로 — 무엇이 좋아졌나

핵심은 열 · 가는 관은 열을 빨리 버리므로 높은 전압을 걸 수 있음

항목슬랩 폴리아크릴아마이드 젤캐필러리 전기영동
열 방출두꺼운 판 → 열이 갇혀 띠가 번짐표면적/부피 비가 커서 열을 빠르게 버림 → 고전압 가능
준비매번 젤을 붓고 굳힘폴리머를 자동으로 다시 채움
로딩손으로 레인마다96웰에서 자동 주입
레인 간 차이레인마다 이동 속도가 다름관마다 독립 · 보정 쉬움
판독 길이수백 염기약 700–1,000 염기 (고품질 기준 수백–900)
처리량하루 수십 샘플96관 × 하루 여러 회
정리

원리는 PART 1의 젤과 같음 — 음전하 DNA가 체를 지나며 크기로 정렬 · 바뀐 것은 체의 모양, 열 관리, 자동화

11-2 예고

캐필러리 생어도 한 번에 한 관 = 한 서열 · NGS는 이것을 수억 개 동시에 하는 방향으로 감

신호에서 서열과 품질값까지

장비가 내놓는 것은 글자가 아니라 네 개의 시계열 · 소프트웨어가 글자와 확신도로 바꿈

원본 신호파장 구간별
세기 vs 시간
▶
분광 분리행렬 M⁻¹
→ 염료 4채널
▶
이동도 보정염료별 위치
차이 맞춤
▶
피크 검출간격 정규화
배경 제거
▶
염기 호출글자 + 품질값
(QV)
▶
.ab1 저장원본 · 처리본
· 호출 · QV
Q = −10 · log₁₀ P P: 그 염기 호출이 틀렸을 확률
QV틀릴 확률정확도
101/1090%
201/10099%
301/1,00099.9%
401/10,00099.99%
  • Phred — 피크 모양 · 간격 · 이웃 피크와의 비율 같은 특징을 확률로 바꾼 방식 (1998) · 오늘날 기기 소프트웨어(KB basecaller 등)도 같은 척도 사용
  • 관례: QV20 이상을 "쓸 만한 염기"로 셈 · 시퀀싱 업체 보고서의 "QV20+ 길이"가 이것
  • 이 Q 척도는 11-2의 FASTQ에서도 그대로 쓰임 — 생어에서 만들어진 언어
주의

QV는 소프트웨어의 추정치 · 혼합 주형처럼 가정이 깨지는 경우엔 높은 QV로 틀린 글자를 내놓기도 함 → 항상 트레이스를 눈으로 확인

Ewing B & Green P, Genome Res 8:186 (1998) · Ewing B et al., Genome Res 8:175 (1998)

Phred — 품질값을 조립으로 연결

Philip (Phil) Green
Philip (Phil) Green
Phred·Phrap 개발의 중심
Brent Ewing 등과 Phred 발표UW Genome Sciences · 대학 사진 인용
Q = −10 log₁₀ P(error)
  • 피크에서 염기를 호출하고 오류 확률을 추정: Phred
  • 겹치는 판독과 품질을 이용해 contig 구성: Phrap
  • Q20: 염기당 오류 확률 0.01 · Q30: 0.001
  • 품질값은 추정치이며 문맥·보정에 영향을 받음
  • 11-2: 겹침과 반복 서열을 함께 검토하며 게놈 조립

Ewing et al., Genome Research (1998) · PNAS · Biography of Phil Green (2004)

PART 4

.ab1과 크로마토그램 읽기

Trace Reading(트레이스 판독) · Troubleshooting(트러블슈팅)

  • .ab1 파일 안에 무엇이 들어 있나
  • 프로그램으로 열기 · 코드로 열기 — 실제 실행
  • 크로마토그램 보는 법 · 믿을 구간과 버릴 구간
  • 나쁜 트레이스 8가지 — 모양 · 원인 · 해결

용어와 파일 — 크로마토그램과 .ab1

시퀀싱 업체에서 받는 파일 중 꼭 받아야 하는 것은 글자 파일이 아니라 .ab1

부르는 이름

Chromatogram(크로마토그램) · Electropherogram(일렉트로페로그램) · Trace(트레이스) 모두 같은 그림 · 시간(=길이)에 따른 네 색 형광 세기 곡선 · 히스토그램은 아님 (도수분포가 아니라 신호 곡선)

파일들어 있는 것
.ab1원본 신호 · 처리 신호 · 염기 호출 · 피크 위치 · QV · 장비 기록 전부
.seq · .fasta글자만 — 틀렸는지 확인할 방법이 없음
.pdf사람이 보기 위한 그림 — 분석·정렬 불가

ABIF 구조 — 이름표(태그) + 번호로 칸을 찾아가는 바이너리 상자

태그번호내용
DATA1–4원본 신호 (분광 분리 전)
DATA9–12처리된 4채널 트레이스 — 우리가 보는 그림
FWO_1채널 순서 (예: "GATC") — DATA9–12와 대응
PBAS2염기 호출 문자열
PLOC2각 염기 피크의 위치 (스캔 번호)
PCON2각 염기의 QV
SMPL1시료 이름
RUND · RUNT1–4분석 날짜 · 시각

Applied Biosystems, ABIF File Format Specification · Biopython Bio.SeqIO.AbiIO 문서

실제로 열기 — 프로그램과 순서

무료 뷰어로 충분 · 중요한 것은 매번 같은 순서로 보는 습관

프로그램운영체제쓰임
SnapGene ViewerWin · Mac · Linux트레이스 보기 · 플라스미드 지도와 정렬 · 무료
UGENEWin · Mac · Linux오픈소스 · 여러 .ab1 정렬 · 콘센서스
4PeaksMac가볍게 트레이스 확인 · 트리밍
ChromasWindows트레이스 보기 · 편집 (라이선스 확인)
Benchling웹레퍼런스에 여러 트레이스 정렬 · 팀 공유
Biopython코드여러 파일 일괄 처리 · 그래프 · 다음 장

실습에서는 학생의 .ab1 파일을 열어 아래 순서로 확인 · 위 화면은 설명용 도식

매번 같은 순서

  1. 전체 보기 — 신호 세기(RFU)와 길이부터 · 수백 이하면 PART 4 갤러리 ②
  2. QV 막대 — 고품질 구간의 시작과 끝 확인
  3. 트리밍 — 앞 수십 · 뒤 저품질 구간 잘라냄
  4. 레퍼런스 정렬 — 기대 서열 · BLAST · 플라스미드 지도
  5. 불일치마다 트레이스 확인 — 글자 말고 피크를 봄
  6. 정방향 · 역방향 합치기 — 두 방향에서 모두 보인 변이만 인정

코드로 열기 — Biopython 실습

.ab1 하나를 읽어 원하는 구간의 트레이스를 직접 그림

read_ab1.py
from Bio import SeqIO
import matplotlib.pyplot as plt

rec = SeqIO.read("sample.ab1", "abi")
raw = rec.annotations["abif_raw"]

seq   = raw["PBAS2"].decode()                  # 염기 호출
qual  = rec.letter_annotations["phred_quality"] # 염기별 QV
peaks = raw["PLOC2"]                           # 피크 위치 (스캔 번호)
order = raw["FWO_1"].decode()                  # 채널 순서, 예: GATC

color  = {"A": "green", "C": "blue", "G": "black", "T": "red"}
traces = {b: raw["DATA" + str(9 + i)] for i, b in enumerate(order)}

print(rec.annotations["abif_raw"]["SMPL1"], len(seq), "nt")
print("QV20 이상:", sum(q >= 20 for q in qual), "nt")

s, e = 100, 140                                # 보고 싶은 염기 구간
x0, x1 = peaks[s] - 10, peaks[e] + 10
fig, ax = plt.subplots(figsize=(12, 3))
for b, y in traces.items():
    ax.plot(range(x0, x1), y[x0:x1], color=color[b], lw=1)
top = max(max(y[x0:x1]) for y in traces.values())
for i in range(s, e):
    ax.text(peaks[i], top * 1.05, seq[i], ha="center", color=color.get(seq[i], "gray"))
ax.set_xlabel("scan"); ax.set_ylabel("RFU")
plt.tight_layout(); plt.savefig("trace_100_140.png", dpi=200)

trimmed = SeqIO.read("sample.ab1", "abi-trim")  # 저품질 양 끝 자동 트리밍
print("트리밍 후:", len(trimmed), "nt")
출력 예
b'Sample_01' 912 nt
QV20 이상: 806 nt
트리밍 후: 798 nt
  • pip install biopython matplotlib 후 실행
  • DATA9–12의 순서는 FWO_1이 정함 — 순서를 가정하면 색이 뒤바뀜
  • abi-trim은 품질 기반(Mott 방식) 트리밍
Claude Code에게 맡긴다면

"data 폴더의 .ab1을 전부 읽어 파일별 QV20 길이를 표로 만들고, QV가 20 미만인 구간을 막대그래프로 그려줘. FWO_1로 채널 순서를 확인할 것" — 요구 조건을 이렇게 명시

크로마토그램 보는 법

좋은 트레이스 = 높이가 비슷한 피크가 같은 간격으로, 한 자리에 한 색만

0 500 1000 RFU T G C A G T C C A T G A A C G T T A G C C T A G 110 120
자체 제작 합성 트레이스 · 위쪽 막대 = QV (초록 ≥ 20 · 노랑 10–19 · 빨강 < 10) · 아래 숫자 = 염기 위치

가로축

스캔 번호 = 시간 = 조각 길이 · 오른쪽으로 갈수록 긴 조각

세로축

형광 세기(RFU) · 절대값보다 이웃 피크와의 비율이 중요

한 피크 = 한 염기

피크 꼭대기 위의 글자가 호출 결과 · 겹친 피크는 N이나 틀린 글자로 나옴

바닥선

피크 아래가 평평해야 함 · 바닥에 작은 피크가 깔리면 혼합 · 오염 의심

한 번의 판독 — 믿을 구간과 버릴 구간

한 반응에서 약 1,000 염기를 내놓지만 전부 믿을 수 있는 것은 아님

프라이머 근처 dye blob 잦은 곳 고품질 구간 (QV20+) 서서히 저하 신뢰 낮음 QV 20 0 20 40 60 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 프라이머로부터의 거리 (nt) QV
자체 제작 개념도 · 위치별 대표적인 QV 모양 · 실제 경계는 주형 · 기기 · 키트에 따라 다름
  • 처음 ~30 nt — 짧은 조각은 분리가 잘 안 되고 프라이머 잔여물과 겹침 → 원하는 부위는 프라이머에서 최소 50 nt 떨어지게 설계
  • ~60–90 nt 근처 — 미반응 염료 종결자가 남으면 넓은 dye blob이 이 근처에 나타나기 쉬움
  • 고품질 구간 — 보통 수백 염기 · 업체 보고서의 QV20+ 길이
  • ~700 nt 이후 — 긴 조각일수록 1 nt 차이의 상대 크기가 작아져 피크가 넓어지고 겹침
  • 1 kb보다 긴 부위 — 반대쪽 프라이머로 역방향 판독 · 가운데에 새 프라이머를 두는 primer walking
  • 중요한 염기 — 양방향 모두 고품질 구간 안에 들어오게 계획

트러블슈팅 갤러리 ① — 신호와 길이 문제

그림을 먼저 보고 원인을 추측한 뒤 설명을 읽기

① 정상

T T T C C T C A T G C A A T T C 210

고른 높이 · 일정한 간격 · 깨끗한 바닥 · QV 대부분 초록

② 신호 약함 · 잡음

T G G C T A G T G T C A C T G C 210

원인 주형 부족 · 프라이머 결합 불량 · 염 과다로 주입 실패 · 해결 주형 농도 재측정, 프라이머 Tm 확인, 정제 다시

③ Dye blob

G G C C C C C C A C G A T C A G 80

원인 반응 후 정리 단계에서 미반응 염료 종결자가 남음 · 해결 정제 다시 · 그 구간만 반대 방향 판독으로 확인

④ 갑작스러운 정지

G C G G C C G C G G C A N N N N 310

원인 GC가 매우 많은 구간 · 머리핀 같은 2차 구조에서 효소가 떨어짐 · 해결 GC-rich 프로토콜 · 첨가제(DMSO · 베타인) · 반대 방향

트러블슈팅 갤러리 ② — 겹침 문제

한 자리에 두 색 — 언제부터, 몇 군데에서 겹치는지가 원인을 알려줌

⑤ 처음부터 전체 이중 피크

C A A C C A A C G C A G T G G T 50

원인 주형이 둘 이상(콜로니 혼합 · PCR 다중 밴드) · 프라이머가 두 곳에 결합 · PCR 프라이머 미제거 · 해결 단일 콜로니 · 밴드 하나 확인 · ExoSAP

⑥ 한 자리만 이중 피크

A C G T T G A C N A G T C T G A 220

의미 이형접합 SNP 가능성 · 또는 집단 속 변이 · 확인 반대 방향에서도 같은 자리에 같은 두 색이 나오는지 · 높이 비율이 대략 1:1인지

⑦ 단일 염기 반복 뒤 미끄러짐

G C T A A A A A A A A C G T C G 160

원인 AAAAAAAA 같은 반복에서 효소가 한두 칸 미끄러져 1 nt 어긋난 사본이 섞임 · 이후 전부 겹침 · 해결 반대 방향 · 반복 뒤쪽에 프라이머

⑧ 앞만 강하고 급히 약해짐 (top-heavy)

C A T G C C T T C T G T G C G A 40

원인 주형이 너무 많아 재료가 앞에서 소진 · 해결 주형을 권장량으로 줄임 · 반대로 신호가 넘치면(off-scale) 피크 꼭대기가 잘림

트러블슈팅 표 — 증상에서 원인으로

결과를 받으면 이 표를 위에서부터 대조

증상먼저 의심할 것확인 방법해결
신호 없음 · 매우 약함주형 부족 · 프라이머 불일치젤 · 흡광도로 주형 양 재확인 · 프라이머 서열 대조주형 증량 · 프라이머 재설계
잡음 많은 바닥약한 신호를 기기가 증폭RFU 수치 확인위와 같음 · 정제 다시
넓은 덩어리 피크dye blob60–90 nt 근처 · 한 색의 넓은 봉우리반응 후 정제 다시
특정 지점부터 신호 소실GC-rich · 2차 구조소실 지점 앞 서열의 GC 비율첨가제 · 다른 프로토콜 · 반대 방향
처음부터 이중 피크혼합 주형 · 프라이머 2곳 결합PCR 젤에 밴드 여러 개? · 콜로니 단일?단일 콜로니 · 밴드 정제 · 프라이머 변경
어느 지점부터 이중 피크반복 서열 미끄러짐 · 삽입/결실 혼합그 지점 직전 서열이 반복인가반대 방향 판독
한 자리만 이중 피크이형접합 · 섞인 집단양방향 같은 위치 재현변이로 보고 · 클로닝 후 분리
모든 피크 밑 작은 그림자분광 보정 틀어짐 · 신호 과다그림자가 항상 같은 색 짝인가주형 줄이기 · 기기 재보정 요청
원칙

하나의 판독만으로 결론 내리지 않음 — 반대 방향 판독이 가장 싸고 강한 확인 수단

판독 워크플로 — 변이를 보고하기까지

기대 서열과 다르다는 결과가 나왔을 때 실제 변이인지 판정하는 절차

  • ① 품질 구간 확인QV · 신호 세기불일치가 고품질 구간 안에 있는가 · 밖이면 판정 보류
  • 통과
  • ② 트레이스 직접 확인글자 말고 피크한 색만 뚜렷한가 · 이중 피크인가 · 주변 피크가 고른가
  • 통과
  • ③ 반대 방향 판독reverse read같은 위치에서 상보 염기로 재현되는가
  • 통과
  • ④ 보고위치 · 변화 · 근거예: c.215C>T — 정방향 QV 52 · 역방향 QV 47 · 이형접합 아님
흔한 실수

정렬 프로그램이 표시한 N이나 불일치만 보고 판정 · 혹은 판독 끝부분 저품질 구간의 불일치를 변이로 보고

DNA 데이터 저장과 연결

합성 올리고 몇 개를 생어로 확인하면 6주차의 결손(n−1) · 치환이 실제로 어디에 생겼는지 볼 수 있음 — 12주차 디코딩 실습 전 단계

퀴즈 2 — 생어와 크로마토그램

문항을 선택하면 해답 표시

ddNTP를 표준보다 10배 많이 넣으면 크로마토그램은 어떻게 바뀌나
짧은 조각이 대부분이 되어 앞부분 신호는 강하고 뒤로 갈수록 급격히 약해짐 → 판독 길이 감소 · 갤러리 ⑧과 비슷한 모양
PCR 산물을 정제하지 않고 그대로 사이클 시퀀싱에 넣으면 왜 처음부터 이중 피크가 생기나
남은 역방향 PCR 프라이머도 반대 가닥에서 신장을 시작함 · 두 방향의 조각이 같은 관에서 섞여 한 위치에 두 신호
QV 30인 염기 500개를 읽었을 때 기대되는 오류 수는
P = 10⁻³ → 500 × 0.001 = 약 0.5개 · QV 20이면 약 5개
AAAAAAAAAA 반복 직후부터 모든 자리가 두 색으로 겹친다 — 어떻게 확인하고 무엇을 보고하나
반복 서열에서의 미끄러짐 의심 · 반대 방향 판독으로 반복 뒤쪽 서열을 깨끗하게 확인 · 반복 길이 자체는 양방향 모두 애매할 수 있으므로 "반복 길이 미확정"으로 보고

생어 시퀀싱의 핵심 원리

밴드 하나에서 출발해 글자 하나까지

  1. 변성이 있어서 Taq가 있음 — 매 사이클 95 °C로 가닥을 풀어야 하므로 열에 강한 효소가 PCR을 자동화함 · 높은 작동 온도는 특이성까지 높임
  2. 3′-OH가 있어서 사슬이 자람 — dNTP는 짝이 맞을 때 들어오고 3′-OH가 α-인산을 공격해 연결 · ddNTP는 3′-H라 그 자리에서 멈춤
  3. 길이는 전기영동이, 염기는 색이 — 1 nt씩 다른 조각을 캐필러리에서 크기 순으로 세우고, 끝에 달린 염료 색으로 마지막 염기를 읽음
  4. 글자보다 트레이스 — .ab1에는 신호와 QV가 함께 있음 · 판정은 고품질 구간 안에서, 피크를 보고, 양방향으로
오늘의 한 문장

생어 시퀀싱은 "어디서 멈췄는가"를 길이로 바꿔 읽는 기술 — 길이는 전기영동이, 마지막 염기는 색이 알려줌

다음 강의 11-2

한 관에 한 서열 · 약 1 kb라는 한계 → 수억 개를 동시에 읽는 Illumina · 긴 분자를 그대로 읽는 Nanopore · PacBio · 그리고 같은 Q 척도를 쓰는 FASTQ

과제

제공된 .ab1 파일 3개 (정상 · 문제 2종) 사용

  1. 트레이스 그리기 — Biopython 실습 코드로 세 파일의 100–140번 염기 구간을 그리고, 파일별 QV20 이상 길이를 표로 정리
  2. 문제 진단 — 문제 파일 2개에 대해 갤러리 ①–⑧ 중 어느 것인지, 근거가 되는 트레이스 위치와 함께 원인 · 해결책 제시
  3. QV 계산 — 한 파일의 QV 평균과, 그 QV들로 기대되는 전체 오류 수(Σ 10−Q/10)를 계산
심화

같은 PCR 산물을 정방향 · 역방향으로 판독한 두 .ab1을 UGENE 또는 코드로 정렬해 콘센서스를 만들고, 한쪽에서만 보이는 불일치가 왜 생겼는지 설명

제출 형식

코드(.py) · 그래프(.png) · 한 쪽 분량 보고서 · 그래프에는 축 이름과 구간 표시

사진·교재·원논문 출처

공개 접근과 자유 재사용은 다름 · 대학·교재·논문 그림의 저작권을 별도로 표기

자료반영 위치출처·권리
인물 사진 7명Taq · 생어 · 자동화 · PhredNLM/NIH, Commons, Wellcome, 대학 원본. 개별 권리표 참조
PCR · 활성 부위 · 기하PART 1 교재 대조Lehninger 7판: Fig.8-33 p.301; Fig.25-5 p.992; Fig.25-6 p.993
dNTP / ddNTP · 생어PART 2 교재 대조Lehninger 7판: Fig.8-34 p.303
생어 젤 (1977)1세대 4레인Sanger et al., PNAS Fig.1 p.5464; araCTP 조건 명시
형광 트레이스 (1986)형광 자동화 뒤Smith et al., Nature Fig.4c p.677; 원본 데이터 발췌
사진·그림·영상의 출처와 확인 기록다음 강의: 게놈 조립과 NGS

참고 문헌

본문 각 슬라이드 하단 출처의 모음

  • Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS 74:5463 (1977)
  • Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA. PNAS 74:560 (1977)
  • Brock TD, Freeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile. J Bacteriol 98:289 (1969)
  • Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 127:1550 (1976)
  • Saiki RK et al. Science 230:1350 (1985) · Saiki RK et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487 (1988)
  • Smith LM et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321:674 (1986)
  • Prober JM et al. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science 238:336 (1987)
  • Tabor S, Richardson CC. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. PNAS 92:6339 (1995)
  • Rosenblum BB et al. New dye-labeled terminators for improved DNA sequencing patterns. Nucleic Acids Res 25:4500 (1997)
  • Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res 8:186 (1998)
  • Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem 274:17395 (1999)

강의 전 서지 정보(권·쪽) 최종 확인 권장

밴드 하나 → 조각 사다리 → 네 색의 곡선 → 글자 하나

11-1: PCR · 사슬 종결 · 4색 형광 · 캐필러리 · .ab1 판독
11-2: 수억 개를 동시에 — Illumina · Nanopore · PacBio · FASTQ

Q and A(질의응답)