MOLECULAR INFORMATION ENGINEERING · WEEK 06 · LECTURE 6-1

Phosphoramidite(포스포라미다이트)
Chemistry(케미스트리·화학)

화학 합성 — 뉴클레오타이드의 순차적 도입

DNA Data Storage 3에서 2 bit/nt로 부호화한 서열을 실제 분자로 바꾸는 단계 · 사이클 4단계의 전자 이동 · Coupling(커플링) 효율이 결정하는 길이의 한계

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Learning Objectives(학습 목표)

합성 사이클의 시약·보호기·전자 이동·부반응의 이해

  1. 포스포라미다이트 단량체에서 보호기 3개와 반응점 1개를 구분하고, 각 보호기를 언제·무엇으로 떼는지 대응
  2. 4단계 사이클(탈트리틸화 · 커플링 · 캡핑 · 산화)을 전자 이동 수준에서 서술
  3. Capping(캡핑)과 Oxidation(산화)를 건너뛸 수 없는 이유를 각각의 부산물(내부 결손 n−1 · 골격 절단)로 설명
  4. 전장 수율 FLP = (효율)n−1로 200-mer 수율을 계산하고, 화학 합성의 실용 상한을 근거와 함께 제시
  5. 무수 조건이 필요한 이유와, 완성된 포스포디에스터가 물에 강한 이유를 같은 인 원자의 Oxidation(산화) 상태 차이로 대비
오늘의 한 문장

화학 합성은 반응점 1개만 남기는 기술이고, 그 한 곳의 성공률 하나가 길이·수율·오류를 모두 결정함

오늘 다루지 않는 것

칩 병렬 합성(DNA Data Storage 6-2) · 효소 합성 TdT(DNA Data Storage 7-1) · 정제와 HPLC(DNA Data Storage 6-2) · 본 강의는 컬럼 1개 위의 화학만

Lecture Map

단량체 → 사이클 → 절단·탈보호 → 수율과 한계

PART 1
단량체와 지지체3′→5′ 방향
보호기 3개 · CPG
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PART 2
4단계 사이클Detritylation(탈트리틸화) · Coupling(커플링)
Capping(캡핑) · Oxidation(산화)의 메커니즘
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PART 3
절단 · 탈보호NH₄OH · β-제거
무수 조건과 가수분해
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PART 4
수율과 한계(효율)ⁿ⁻¹
200 nt · 폐기물
  • 각 단계는 시약 · 농도 · 시간 · 전자 이동 · 부반응의 다섯 항목으로 고정해 서술
  • 부반응은 모두 정제 가능성의 문제로 환원됨 — DMT가 붙은 채 남는 오류가 가장 나쁜 오류
  • 마지막에 같은 사이클을 다시 띄우고 2026년에 바뀌고 있는 것을 겹쳐 봄
DNA Data Storage 1–5와의 연결

DNA Data Storage 3에서 2 bit/nt 매핑으로 만든 서열을 지금 실제로 합성함 · DNA Data Storage 5 올리고 구조(프라이머+인덱스+데이터+ECC)의 총 길이가 오늘 계산할 합성 한계 안에 들어가야 함

복습 — DNA 데이터 저장의 합성 단계

DNA Data Storage 2의 저장 워크플로 — 합성 단계의 반응 화학

① 인코딩디지털 → 염기서열
DNA Data Storage 3
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② 합성서열 → 실제 DNA
DNA Data Storage 6 · 7
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③ 보관건조 · 캡슐화
DNA Data Storage 8
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④ 접근PCR · 프로브
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⑤ 시퀀싱DNA → 서열
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⑥ 디코딩서열 → 디지털
DNA Data Storage 1–5에서 이미 정해진 것

DNA Data Storage 1 저장 매체로서의 DNA · DNA Data Storage 2 6단계 워크플로 · DNA Data Storage 3 2 bit/nt 인코딩 · DNA Data Storage 4 Reed–Solomon과 XOR · DNA Data Storage 5 올리고 구조(프라이머 + 인덱스 + 데이터 + ECC)

합성 반응과 오류 발생

"서열 → 실제 DNA"의 화살표 안에서 반응 종류와 반복 횟수 · 그 반응의 실패가 DNA Data Storage 4에서 배운 오류(결손 · 삽입)의 물리적 기원임

DNA Data Storage 6–7의 구성

6-1(오늘) 화학 합성 — 포스포라미다이트
6-2 칩 병렬 합성 · 올리고 풀 · 정제
7-1 효소 합성(TdT) · 오류 제거 · 유전자 조립
7-2 XNA — 구조 · 합성 · 진단 · 치료

오늘의 출발 질문

화학 합성의 200 nt 한계 — 사이클 한 칸의 효율에 기인

비용 수치는 DNA Data Storage 2 강의 참조 · 본 강의는 화학 기구에 한정

복습 — DNA와 RNA의 당·염기 구조

대표 구성 뉴클레오타이드 dTMP와 UMP · 공통의 5′ 인산기 · 당의 2′ 치환기 비교

DNA · Deoxyribonucleic acid(디옥시리보핵산)

1′2′3′4′
dTMP · Thymidine monophosphate(티미딘 모노포스페이트)
2′ 위치 — HDeoxyribose(디옥시리보스) · 2′-OH 부재

대표 염기: Thymine(티민, T) · 5-메틸기(CH₃)
일반적인 염기 구성: A · G · C · T

RNA · Ribonucleic acid(리보핵산)

1′2′3′4′
UMP · Uridine monophosphate(유리딘 모노포스페이트)
2′ 위치 — OHRibose(리보스) · 2′-OH 존재

대표 염기: Uracil(유라실, U) · 5-메틸기 부재
일반적인 염기 구성: A · G · C · U

합성 화학과의 연결

RNA의 추가 2′-OH → 선택적 보호 필요 · DNA와 RNA 모두 3′–5′ Phosphodiester(포스포디에스터) 골격으로 연결

구조: PubChem dTMP, CID 9700 · UMP, CID 6030 · 입체화학을 보존한 RDKit 자체 제작 SVG · 비교 그림은 단일 뉴클레오타이드, 염기서열 전체가 아님

PART 1

단량체와 지지체

Monomer(모노머·단량체), Protecting Groups(프로텍팅 그룹스·보호기), Solid Support(솔리드 서포트·고체 지지체)

  • 합성 방향이 생체와 반대인 이유 — 3′→5′
  • 포스포라미다이트의 보호기 3개와 반응점 1개
  • CPG 고체 지지체 — 세척에 의한 정제 구조
  • 단량체의 3차원 형태 — 입체장애와 Coupling(커플링) 속도

화학 합성과 생체 합성의 신장 방향

보호기 도입과 말단 반응점에 따른 합성 방향

생체 내 — DNA 중합효소

  • 5′→3′ 방향으로 신장 · 기존 사슬의 3′-OH에서 반응
  • Template(템플릿·주형)에 따른 염기 연결
  • 기질 = dNTP · 이탈기 = 피로인산
  • 수용액 · 중성 pH · 체온

화학 합성 — 포스포라미다이트

  • 3′→5′ 방향으로 신장 · 기존 사슬의 5′-OH에서 반응
  • 주형 없이 설계 서열에 따른 염기 연결
  • 기질 = 포스포라미다이트 · 이탈기 = 다이아이소프로필아민
  • 무수 유기용매 · 산 처리 · 실온
  • 거꾸로인 이유: 5′-OH는 일차 알코올, 3′-OH는 이차 알코올 → 부피가 큰 DMT를 5′에만 선택적으로 도입 가능
  • 기존 사슬의 5′-OH와 새 단량체의 3′-O–P 연결 → 새 단량체의 5′ 말단이 다음 반응점 → 3′→5′ 신장
  • 인(P)을 3′에 남긴 표준 단량체 → 지지체에 고정된 3′ 말단에서 5′ 방향으로 사슬 신장
  • 올리고 주문 표기 5′→3′ · 합성 시작점은 3′ 말단 염기가 붙은 비드
DNA Data Storage 5와의 연결

올리고 구조를 5′ 프라이머 → 인덱스 → 데이터 → ECC 순으로 설계했다면, 합성기는 그 역순으로 만듦 · 3′ 말단 쪽 ECC 구간이 가장 먼저, 가장 온전하게 만들어짐

김영창·노동현·김용대·김양훈, 《합성생물학》, 충북대학교 출판부, 7.1 · ATDBio Nucleic Acids Book, Solid-phase oligonucleotide synthesis

Phosphoramidite(포스포라미다이트)

화학 합성(보호기 3개, 반응점 1개)

당 탄소 번호 — 1′ 염기 연결 · 3′ 인 연결 · 5′ DMT 보호 1′2′3′4′5′
당 탄소 번호 1′–5′ · 1′ 염기 · 3′ 인 · 5′ DMT
5′-O–DMT 매 사이클 3% TCA 염기 N–Bz · N–iBu 최종 NH₄OH · 55 °C O–CH₂CH₂CN 최종 NH₄OH β-제거 N(iPr)₂ 활성화 시 아미노기 이탈 O 디옥시리보스 P 1′ 2′ 3′ 4′ 5′

번호 색상 — 1′ 초록: 염기 연결 · 3′ 파랑: 인 연결 · 5′ 빨강: DMT 보호
2′·4′ 남색: 당 골격 · 밝은 파랑: 인의 아미노기 · 붉은 점: P(III) 비공유전자쌍

DMT 보호기와 양이온의 색상

DMT 보호기 자체는 무색 · 산 처리로 분리된 DMT 양이온의 주황색(λmax 495 nm)

ATDBio Nucleic Acids Book · Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 2 · 9 · 10 · 구조식은 RDKit 생성

3D Structure of a Phosphoramidite Monomer

끌어서 돌리기 · 휠 확대
  • P 주변에 세 개의 큰 치환기가 모여 있음 — 3′-O(뉴클레오사이드) · O-시아노에틸 · N(iPr)₂
  • Coupling(커플링)은 이 붐비는 P를 5′-O가 정면에서 공격하는 반응 → 입체장애가 크면 Coupling(커플링) 시간이 길어짐
  • 실측 예: 2′-TBDMS RNA 아미다이트는 입체장애가 커서 활성화제에 따라 Coupling(커플링) 시간이 BTT 약 3분 vs 테트라졸 10~15분
  • DNA 아미다이트는 상대적으로 덜 붐빔 → 표준 Coupling(커플링) 30 s
원소 색상
인(P) · 주황산소(O) · 빨강질소(N) · 파랑탄소(C) · 회색수소(H) · 흰색

Glen Research, Glen Report 19.29, About Activators: Now and Tomorrow · 좌표는 RDKit ETKDG 생성 · 뷰어 3Dmol.js

고체 지지체 CPG — 제품과 세공 도식

고체 지지체의 사용 이유 — 넓은 비표면적 · 시약 침투 · 하부 배출과 세척

판매되는 CPG 합성 플레이트

흰색 96웰 올리고 합성 플레이트와 Embed CPG 프릿 제품 사진
Biocomma · 96웰 합성 플레이트 · Embed™ CPG 프릿
상부 시약 투입↓웰 내 CPG 지지체↓하부 프릿 · 액체 배출
지지체 유지 · 액체 교체

프릿: CPG 유지 · 시약과 세척 용매의 통과
미반응 시약과 부산물의 배출 → 다음 반응 준비

세공과 표면 연결 사슬 — 기존 도식

CPG 비드 controlled pore glass · 세공 크기 균일 세공 표면 확대 유리 –O–Si– LCAA 스페이서 –NH₂ (반응점) 숙시닐 에스터 첫 뉴클레오사이드 3′-O 5′-O–DMT (출발) 마지막에 이 에스터만 가수분해
  • 비표면적 확대 — 연결된 세공 내부의 넓은 표면 → 사슬을 고정할 반응점 확보
  • 시약 접근성과 물질전달 — 세공을 통한 시약 침투 · 고정된 사슬의 반응점 접근
  • 원활한 유동과 세척 — 하부 배출구를 통한 액체 흐름 · CPG를 유지한 채 과잉 시약·부산물 제거

제품 사진: Biocomma, Oligo Synthesis Plates with Embed™ CPG Frits · 기존 도식: 김영창 외, 《합성생물학》 7.1.2 · 다음 페이지: 실제 세공 구조 비교

CPG ① — 세공 구조와 고체상 합성

액상이 아닌 고체 위에서 합성하는 이유 — 넓은 내부 표면 · 사슬 고정 · 반복 세척

NIST 실제 CPG SEM 사진 — 서로 연결된 다공성 유리 구조
CPG의 연결된 세공 구조 · SEM · NIST
표준물질의 형태 예시
  • CPG · Controlled pore glass(컨트롤드 포어 글라스) — 세공 크기를 제어한 다공성 유리 · 단단한 골격과 넓은 내부 표면
  • 표면의 분자 고정 — LCAA 스페이서와 숙시닐 연결기를 통한 첫 뉴클레오사이드의 3′ 말단 고정
  • 넓은 비표면적과 세척 경로 — 많은 표면 반응점 · 시약의 침투와 물질전달 · 하부 배출에 의한 미반응 시약·부산물 제거
표면 고정→시약 투입→세척→다음 사이클

입자 크기와 세공 크기의 구분 · 너무 작은 세공은 시약 확산과 사슬 신장을 제한

제조 조건에 따른 실제 세공 구조 변화

알칼리 식각 시간 8 → 24 → 48 h · 원그림의 축척 유지

8 h — 미세 세공 형성

8 h — 미세 세공 형성 나노다공성 유리의 실제 전자현미경 사진
원그림 d · 축척 막대 0.2 µm

24 h — 연결된 세공

24 h — 연결된 세공 나노다공성 유리의 실제 전자현미경 사진
원그림 e · 축척 막대 0.2 µm

48 h — 확대된 세공

48 h — 확대된 세공 나노다공성 유리의 실제 전자현미경 사진
원그림 f · 축척 막대 0.5 µm

사진의 표시 크기와 실제 세공 크기의 구분 — 서로 다른 축척 막대 확인 · 다음 페이지: 표면 고정화의 결합 화학

상단 SEM: NIST, SRM Spotlight (2012), p.2 · 하단 SEM: Shakhgil’dyan et al., Glass Ceram. 75, 377–382 (2019), Fig. 2d–f · 김영창 외, 《합성생물학》 7.1.2

CPG ② — 표면 고정화와 절단 화학

한 표면 반응점의 분자 연결 — 3′ 말단 고정 · 5′ 방향 신장 · 최종 에스터 절단

한 표면 반응점의 분자 연결

DMT OO B₂3′ OP OOCE O5′ OB₁ 3′O CO ONH OSi 5′ 방향 사슬 신장 추가 잔기 첫 잔기 3′ 말단 고정 에스터 절단 숙시닐 연결기 –CO–CH₂CH₂–CO– LCAA 장쇄 스페이서 CPG 세공 내부 표면
B: 염기 · CE: 2-시아노에틸 · LCAA 길이 축약
컬럼 내 다수 사슬 중 한 반응점의 확대
① Spacer(스페이서) — 표면과 사슬 사이의 거리 확보

LCAA · Long chain alkylamine(롱 체인 알킬아민) · 말단 일차아민의 연결 반응 · 유리 표면으로부터 사슬 분리와 입체장애 완화

CPG–LCAA–NH–C(=O)–CH₂–CH₂–C(=O)–O–3′-dN
아미드 결합 ← 숙시닐 연결기 → 에스터 결합
② Linker(링커) — 숙시닐 연결기의 양쪽 결합

LCAA 아민 쪽: Amide(아미드) 결합 · 뉴클레오사이드 3′-OH 쪽: Ester(에스터) 결합 · 5′-DMT 제거 후 5′ 말단에서 다음 단량체 도입

③ Cleavage(절단) — 최종 올리고 회수

암모니아 처리에 의한 숙시닐 에스터의 절단 → 3′-OH 회복 · 고체 지지체에서 사슬 분리 · 염기·인산 보호기 제거의 병행

CPG 1000 Å의 실제 SEM 사진 — 원본의 100 nm 축척 막대 포함
CPG 1000 Å = 100 nm · SEM
원그림 축척 막대: 100 nm

세공 크기와 올리고 길이

500 Å = 50 nm · 짧은 올리고
1000 Å = 100 nm · 약 100 nt까지
2000 Å = 200 nm · 더 긴 올리고

사슬 신장에 따른 시약 확산 제한 · 대세공 지지체의 낮은 로딩과 취약성

연결·절단: ATDBio, Solid-phase oligonucleotide synthesis, Figs. 7, 24 · SEM: Haverkamp et al., RSC Adv. 14, 12735–12741 (2024), ESI Fig. 1 · CPG 내부 사슬 중 한 반응점의 확대

CPG 합성 — 실제 제품과 합성 공정

본문 개념과 영상의 실제 공정·반응 기전 비교 · 재생 버튼 선택

Gene Synthesis by GeneArt®

Thermo Fisher Scientific (4:11)YouTube에서 보기 ↗

본문 영상

관찰할 내용

볼 것 — 실제 공장: 필터를 찍어 웰에 넣고 CPG를 채운 뒤 자동 합성 · 하루 13,500 올리고 (Thermo Fisher GeneArt) — 후반 PCR 조립은 7-1에서 다시

개념 연결

  • 웰·CPG·사슬 고정점의 대응
  • 시약 투입·세척·절단의 실제 흐름

영상: Thermo Fisher Scientific · YouTube 제목·제작자 확인: 2026-10-07

PART 2

4단계 사이클

Detritylation(탈트리틸화) · Coupling(커플링) · Capping(캡핑) · Oxidation(산화)

  • 사이클 전체 — 시약 · 농도 · 시간
  • 각 단계의 분자 수준 메커니즘 — 전자쌍의 이동 경로
  • 각 단계가 만드는 부반응과 그 부산물의 정제 가능성
  • DMT 양이온의 색상 · 산화 후 인산 골격의 구분

4단계 합성 사이클 — 뉴클레오타이드의 순차적 도입

사이클 n−1회 반복 → n-mer 완성

Detritylation(탈트리틸화) → Coupling(커플링) → Capping(캡핑) → Oxidation(산화)

① Detritylation(탈트리틸화) 3% TCA / DCM · 50 s ② Coupling(커플링) 0.1 M 아미다이트 + 0.5 M 테트라졸 · 30 s ③ Capping(캡핑) Ac₂O/피리딘/THF + NMI · 30 s ④ Oxidation(산화) 0.015 M I₂ / H₂O / 피리딘 · 45 s CPG 사슬 n 새 염기 (n+1) 5′-O–DMT · 반응성 0 자유 5′-OH 노출 5′-O–P(III)–O 결합 미반응 5′-OH → 5′-O-Ac P(V) 포스포트리에스터 DMT⁺ 주황 매 단계 사이 — 아세토니트릴 세척 30 s + 아르곤 플러시 10 s

ATDBio Nucleic Acids Book, Solid-phase oligonucleotide synthesis · Biotage white paper PPS676 (2022) Table 1

4단계 합성 사이클 — 반응 애니메이션

본문 개념과 영상의 실제 공정·반응 기전 비교 · 재생 버튼 선택

Educational video oligo synthesis

Cytiva (1:37)YouTube에서 보기 ↗

영상 선택

관찰할 내용

볼 것 — Cytiva 애니메이션의 순서는 Detritylation(탈트리틸화) → Coupling(커플링) → Oxidation(산화) → Capping(캡핑) . 오늘 위젯(캡핑 → 산화)과의 순서 차이 비교

개념 연결

  • 탈보호·연결·봉인·산화의 목적
  • Cytiva 영상과 강의 위젯의 캡핑·산화 순서 비교

영상: Cytiva · METTLER TOLEDO AutoChem · YouTube 제목·제작자 확인: 2026-10-07 · 긴 강연은 필요한 구간을 선택하여 시청

Synthesis Cycle(합성 사이클) — 시약과 반응 조건

대표 시약·용매·시간과 반응 결과 · 조건은 합성기와 프로토콜에 따라 조정

Step
(단계)		Reagents / Solvent
(시약 / 용매)		Time
(시간)		Reaction
(반응)		Failure
(실패 시 결과)
① Detritylation
(탈트리틸화)		3% Trichloroacetic acid (TCA)
(트리클로로아세트산)
in Dichloromethane (DCM)
(디클로로메탄)		50 s5′-DMT removal → free 5′-OH
(5′-DMT 제거 → 자유 5′-OH 노출)		Blocked chain extension
(다음 뉴클레오타이드의 도입 차단)
② Coupling
(커플링)		0.1 M Phosphoramidite(포스포라미다이트)
+ 0.5 M 1H-Tetrazole(1H-테트라졸)
in Acetonitrile (ACN)(아세토니트릴)		30 sNucleophilic attack on P(III) → phosphite triester
(P(III)에 대한 친핵 공격 → 포스파이트 삼중에스터)		Failed nucleotide incorporation
(해당 사이클의 뉴클레오타이드 도입 실패)
③ Capping
(캡핑)		Cap A: Acetic anhydride(무수아세트산) / Pyridine(피리딘) / THF 1:1:8
Cap B: 16–17.6% w/v N-Methylimidazole (NMI)(N-메틸이미다졸)		30 sAcetylation of unreacted 5′-OH
(미반응 5′-OH의 아세틸화 → 영구 신장 차단)		Internal deletion (n−1)
(미반응 말단의 후속 신장 → 내부 결손)
④ Oxidation
(산화)		0.015 M Iodine (I₂)(요오드)
in Water(물) / Pyridine(피리딘) / THF 2:20:78		45 sP(III) → P(V) phosphate triester
(P(III) → P(V) 포스포트리에스터)		Acid-induced backbone cleavage
(다음 산 처리 단계의 골격 절단)
Wash / Flush
(세척 / 플러시)		Acetonitrile wash(아세토니트릴 세척)
Argon flush(아르곤 플러시)
(각 단계 사이)		30 s
10 s		Reagent removal; prevention of carryover
(이전 시약 제거 · 잔류 시약의 혼합 방지)		Cross-reactions; reduced efficiency
(교차 반응 · 효율 저하)

THF = Tetrahydrofuran(테트라하이드로퓨란) · Oxidation product(산화 산물): 2-시아노에틸로 보호된 포스포트리에스터 · 포스포디에스터는 최종 탈보호 후 형성

ATDBio, Nucleic Acids Book · Biotage white paper PPS676 (2022), Table 1, Figs. 6, 8

Detritylation(탈트리틸화) — 반응 메커니즘

SN1 반응에 의한 DMT 제거 · 산 유도 Depurination(탈퓨린화)

3% TCA / DCM · 50 s — 그리고 depurination(디퓨리네이션·탈퓨린화)

CPG 사슬 n O 디옥시리보스 O T DMT Cl₃C–COO–H TCA · pKa ≈ 0.7 · 3% in DCM · 50 s + DMT⁺ H 자유 5′-OH 완성 C⁺ C₆H₄–OMe C₆H₄–OMe C₆H₅ para-OMe 산소의 비공유전자쌍이 고리로 밀려 들어가 quinoidal(퀴노이달) 공명 λmax 495 nm · ε₄₉₅ = 71,700 M⁻¹cm⁻¹ → trityl(트리틸) monitoring(트리틸 모니터링) CPG 사슬 n O C1′ 5′-OH Cl₃C–COO–H 같은 TCA · 같은 50 s dA (아데닌) N7 + N7 양성자화 → 염기의 이탈능 증가 dA 단량체 반감기 — 3% TCA 19분 · 3% DCA 77분 · 15% DCA 약 26분 사슬 내부 dA는 양쪽 포스포트리에스터에 보호되어 약 20배 안정 dG는 dA보다 느림 — 3% TCA에서 약 12배 긴 반감기 당 양이온 → H₂O 부가 → 무염기 자리 형성 Apurinic/apyrimidinic site(무염기 자리) 합성 중에는 조용함 — 사이클은 그대로 계속 진행 암모니아 탈보호 때 그 자리에서 사슬이 절단됨 → 3′-말단이 잘린 DMT-ON truncated(트렁케이티드·절단 산물) 종 발생 전장 산물과 DMT 유무가 같아 트리틸 기반 정제로 못 걸러냄 아데닌 이탈

Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 2 · Glen Report 21.211 · Kinetic Studies on Depurination and Detritylation of CPG-Bound Intermediates, Nucleic Acids Res. 24(15):3053 (1996)

Detritylation(탈트리틸화) — 구조식과 전자 이동

티미딘(T)의 실제 원자·결합 구조 · 양성자화와 이종 결합 절단 · 5′-OH 생성

Protonation(양성자화) → Bond cleavage(결합 절단) → Products(생성물)

5′-O–DMT protected nucleoside(보호된 뉴클레오사이드) Protonated ether(양성자화된 에터) Trichloroacetic acid(TCA) 3% TCA in DCM · 50 sDichloromethane(디클로로메탄) O → H⁺Protonation(양성자화) C–O bond cleavage(C–O 결합 절단) Free 5′-OH(자유 5′-OH) +DMT⁺ · Triarylmethyl cation(트리아릴메틸 양이온) 전자 공여 메톡시기와 양이온 중심의 강조

ATDBio, Solid-phase oligonucleotide synthesis, Detritylation mechanism · 티미딘 입체화학: PubChem CID 5789 · 자체 제작 RDKit SVG · R: 3′ 연결기–CPG · 보호기·연결기 도입은 강의용 모델

DMT 양이온의 흡광 특성과 합성 효율 측정

보호기는 무색, 양이온은 주황 · 공명에 따른 색 변화

  • 중심 탄소의 빈 p 오비탈에 세 고리의 π가 겹침 · 여기에 두 개의 para-OMe 산소가 전자쌍을 밀어 넣어 옥소카베늄 공명 구조를 만듦
  • 공명이 확장되며 HOMO–LUMO 간격이 좁아짐 → 흡수가 가시광으로 이동
Trityl signal(트리틸 신호)의 의미

결합된 DMT 보호기의 무색 · 산 처리로 분리된 DMT⁺의 주황색 · 폐액 흡광도에 의한 탈보호량 측정의 근거

흡수 스펙트럼 (개념도) λmax 495 nm 400500 600700 nm 흡수 = 청록 보이는 색 = 주황 장비별 측정 파장 498 · 510 nm ε₄₉₅ = 71,700 M⁻¹cm⁻¹ → 폐액 흡광도로 DMT⁺ 정량 → 사이클별 효율 실시간 추적
합성기가 보여주는 그래프

사이클마다 이 흡광도를 막대로 표시함 → 효율이 떨어지기 시작하는 사이클을 눈으로 확인 가능 · 장쇄 합성에서 어디서 무너졌는지 사후 추적의 1차 자료

ATDBio Nucleic Acids Book · Biotage PPS676 (2022) p.5 · Loading Determination of DMTr-substituted Resins for Large-scale Oligonucleotide Synthesis, PubMed 38666611 (2024)

Jablonski 다이어그램 — 광흡수와 전자전이

전자 에너지 준위 · 방사·비방사 전이 · 에너지 차이와 파장의 관계

Energy(에너지) S₀S₁S₂T₁ Singlet states(단일항 상태)Triplet state(삼중항 상태) Absorption(광흡수) Vibrational relaxation(진동 이완) Internal conversion(내부전환) Fluorescence(형광) Intersystem crossing(계간전이) Phosphorescence(인광) S₀: 바닥 상태 · S₁/S₂: 들뜬 단일항 상태T₁: 들뜬 삼중항 상태
실선 수직 화살표: 빛의 흡수·방출 · 곡선 화살표: 비방사 전이 · 에너지 준위는 개념 모식도
에너지와 파장

ΔE = hν = hc / λ

짧은 파장 → 높은 광자 에너지
긴 파장 → 낮은 광자 에너지

495 nm의 광자 에너지

E ≈ 1240 / 495
≈ 2.50 eV

400 nm: 3.10 eV
700 nm: 1.77 eV

DMT 측정과의 연결

DMT⁺의 495 nm 흡수 → 폐액 흡광도 측정 · Absorption(흡수) 경로에 해당

형광·인광은 일반 광물리 과정의 비교 · DMT⁺의 발광 측정 결과를 의미하지 않음

IUPAC Gold Book, Jablonski diagram (J03360) · Florida State University, Molecular Expressions · DMT⁺ 흡수: ATDBio, Nucleic Acids Book · 자체 제작 SVG

TCA와 DCA — 산성도와 DMT 제거 원리

시약의 화학 구조 · 수용액 pKa와 용액 pH의 구분 · 산 촉매 에터 절단

TCA · Trichloroacetic acid
(트리클로로아세트산)

CCl₃COOH · 염소 치환기 3개
수용액 pKa ≈ 0.7

DCA · Dichloroacetic acid
(디클로로아세트산)

CHCl₂COOH · 염소 치환기 2개
수용액 pKa ≈ 1.3

전자 유도 효과와 산성도

염소 치환기의 전자끌기 → 카르복실레이트 음이온 안정화 · 물에서 TCA가 DCA보다 강한 산

pKa와 pH

pKa = −log Kₐ · 산의 해리 평형
pH = −log a(H⁺) · 용액의 수소 이온 활성도
실제 pH는 농도·용매·평형 조건에 의존

DMT 제거의 반응 순서

① Protonation(양성자화)

5′-O–DMT 에터 산소의 양성자 수용

Sugar–O–C(Ar)₃ + H⁺
→ Sugar–O⁺(H)–C(Ar)₃
② Heterolysis(이종 결합 절단)

C–O 결합 전자쌍의 산소 쪽 이동

Sugar–O⁺(H)–C(Ar)₃
→ Sugar–OH + ⁺C(Ar)₃
③ Products(생성물)

자유 5′-OH · 공명 안정화된 DMT⁺
용액 흐름에 의한 DMT⁺ 제거 → 탈보호 진행

실제 합성 조건의 해석

DCM(디클로로메탄)은 비수계 용매 · 수용액 pKa를 합성 용액의 pH로 해석하지 않음 · 산 농도·전달량·반응 시간을 함께 비교

TCA pKa: IARC, Trichloroacetic Acid · DCA pKa: PubChem CID 6597 · 비수계 탈트리틸화: Org. Biomol. Chem. (2009), DOI: 10.1039/B816235B · Ar: 아릴기 · 구조식: 자체 제작 RDKit SVG

탈트리틸화 시약의 산성도와 선택 기준

TCA와 DCA의 탈보호 속도·반응 시간·Depurination(탈퓨린화) 부반응 비교

항목3% TCA (수용액 pKa ≈ 0.7)3% DCA (수용액 pKa ≈ 1.3)15% DCA
dA 단량체(dA-CPG) depurination(디퓨리네이션·탈퓨린화) 반감기19분77분약 26분
사슬 내부 dA 반감기 (DMT-Tp-dAp-T-CPG)약 6.3시간약 25시간약 8.3시간
탈트리틸 99% 완결 시간 — CPG-이량체약 75 s약 90 s약 60 s
탈트리틸 99% 완결 시간 — CPG-17-mer약 270 s (tailing(테일링) 심함)약 135 s약 116 s
  • 산을 약하게 하면 depurination(디퓨리네이션·탈퓨린화)은 줄지만 탈트리틸이 느려짐 → deblock(디블록·탈트리틸화) 시약 전달량을 2배로 늘려 보상
  • 사슬이 길어질수록 탈트리틸이 어려워짐 — 17-mer에서 3% TCA는 270 s가 필요하고 tailing이 심함 → 장쇄 합성에서 TCA는 이중으로 불리
  • 그래서 현대 대규모 합성은 TCA → DCA로 이동 · 2026년 현재 3% DCA in Toluene(톨루엔)(Glen 40-4240)까지 상업 판매
  • 단 톨루엔계 deblock(디블록·탈트리틸화)은 전도도식 trityl(트리틸) 모니터와 비호환 — 실시간 효율 측정 방식의 변경 필요
탈퓨린화 산물의 절단과 분리 특성

depurination(디퓨리네이션·탈퓨린화)이 만드는 Apurinic/apyrimidinic site(무염기 자리)는 탈보호 때 절단되어 DMT-ON truncated(트렁케이티드·절단 산물)가 됨 · 산 처리 중 탈퓨린화 → 최종 탈보호 시 사슬 절단 → DMT-ON 부산물의 분리 곤란(DNA Data Storage 7-1)

Glen Research, Glen Report 21.211 · Kinetic Studies on Depurination and Detritylation of CPG-Bound Intermediates, Nucleic Acids Res. 24(15):3053 (1996) · Glen Report 37-26 (2025/26)

② Coupling(커플링) — 활성화 3단계와 율속 단계

테트라졸은 산이면서 친핵체 · 두 역할을 순서대로 수행

0.1 M 아미다이트 + 0.5 M 테트라졸 · 30 s

CPG 사슬 n 지지체 5′–O–H 지지체 5′–O–P P 새 염기 3′-O 5′-O–DMT (다음 사이클용) O–CH₂CH₂CN N(iPr)₂ 1H-테트라졸 N–H pKa 4.8 · 0.5 M in ACN + − 이 친핵 치환이 율속 단계 (rate-determining(레이트 디터미닝·율속)) HN(iPr)₂ 이탈 (중성) 테트라졸라이드 활성종 phosphorotetrazolide(포스포로테트라졸라이드) 테트라졸라이드 이탈 포스파이트 삼중에스터 P(III) 완성 P(III)는 산에 불안정 다음 사이클 TCA에서 골격이 끊어짐 → Oxidation(산화) 필수

Glen Research, Glen Report 10.11 · 원저 Dahl, Nielsen & Dahl, Nucleic Acids Res. 15:1729 (1987) · Biotage PPS676 (2022) Fig. 3

활성화제의 선택 — 산성도와 친핵성의 균형

더 센 산이 항상 더 좋은 활성화제는 아님

활성화제pKaACN 용해도특징
1H-테트라졸4.80.5 M표준 · 교과서 조건의 기준
ETT (5-에틸티오)4.30.75 M더 산성 · 더 빠른 활성화
BTT (5-벤질티오)4.10.44 M가장 산성 · 입체장애 큰 2′-TBDMS RNA Coupling(커플링) 약 3분
DCI (4,5-다이시아노이미다졸)5.21.1~1.2 M산성은 약하나 친핵성이 커서 Coupling(커플링) 속도 2배 · 장쇄 권장
  • 실측 극단 예 — 1 mmol 규모 34-mer, 모노머 2당량: 0.45 M 테트라졸 0%(검출 안 됨) · 테트라졸 + 0.1 M NMI 13% · 1 M DCI 54%
  • 소규모 합성(<15 µmol)에서 DCI 최적 농도는 0.25 M
  • 입체장애 비교 — 2′-TBDMS RNA 아미다이트: BTT 약 3분 vs 테트라졸 10~15분
n+1 부반응

활성화제가 너무 산성이면 모노머 용액 안에서 dG 아미다이트의 DMT를 일부 벗김 → GG 이량체 아미다이트 → 한 사이클에 2염기 삽입 · 이 n+1도 DMT-ON이라 정제 곤란 → 장쇄엔 BTT·ETT보다 DCI

Glen Research, Glen Report 19.29, About Activators: Now and Tomorrow · Glen Report 10.11 · Glen Report 21.211 · 원저 Krotz et al., Tetrahedron Lett. 38:3875 (1997) · 구조식은 RDKit 생성

③ Capping(캡핑) — NMI에 의한 아실화제 생성

무수아세트산 단독으로는 느림 · NMI가 더 강한 아실화제로 바꿈

Ac₂O/피리딘/THF + NMI · 30 s

CPG 사슬 n 미반응 5′–O–H CH₃–C(=O)–O–C(=O)–CH₃ Capping(캡핑) A — Ac₂O / 피리딘 / THF 1:1:8 C N-메틸이미다졸 (NMI) Capping(캡핑) B — 16~17.6% w/v in ACN · 30 s N CH₃COO⁻ 이탈 N-아세틸-N-메틸이미다졸리움 ⊕ · 강한 아실화제 C NMI 이탈 (재사용 가능) 5′-O–아세틸 (봉인) 영구 정지 — 이 사슬은 truncated(트렁케이티드·절단 산물)로 남음 길이가 짧고 DMT도 없음 → 이후 정제로 분리 가능 피리딘의 역할 — 생성된 아세트산이 DMT를 벗기지 못하게 염기성을 유지

Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 5 · ATDBio Nucleic Acids Book · Glen Research, Glen Report 21.211

Capping(캡핑)의 역할과 내부 결손 형성

설계 철학: 못 고칠 오류를 분리 가능한 오류로 바꿈

Capping(캡핑) 없음 DMT 전장 산물 결손 DMT 내부 결손 미반응 5′-OH를 살려두면 다음 사이클에 붙어버림 → 중간이 한 칸 빠진 n−1 집단이 생김 실선 칸 5개 vs 6개 — 길이 차이 1 nt · DMT 유무도 동일 → 트리틸 기반·길이 기반 정제로 모두 분리 곤란 Capping(캡핑) 있음 DMT 전장 Ac truncated(트렁케이티드·절단 산물) · DMT 없음 실패한 사슬은 그 길이에서 영구 정지 → 길이 차이가 크고 5′에 DMT가 없음 HPLC · PAGE · DMT 기반 카트리지로 분리 가능 → DNA Data Storage 7-1 정제 파트의 전제 조건이 여기서 만들어짐

ABI 394

Capping(캡핑) B의 NMI 16% — Capping(캡핑) 효율 약 97%

Expedite 8909

Capping(캡핑) B의 NMI 10% — 약 90%

ABI 394 + 10% NMI

NMI를 낮추면 89%로 하락

Capping(캡핑) B → 6.5% DMAP

ABI 394에서 >99%

Glen Research, Glen Report 21.211, Synthesis of Long Oligonucleotides · Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 4

④ Oxidation(산화) — P(III) → P(V) 포스포트리에스터

요오드가 인을 친전자체로 바꾸고, 물이 산소를 넣어줌

0.015 M I₂ / H₂O / 피리딘 / THF · 45 s

P 지지체 사슬 5′-O O–CH₂CH₂CN 새 염기 3′-O I I 0.015 M I₂ · 45 s H₂O 피리딘 I + iodophosphonium(아이오도포스포늄) I⁻ + I⁻ O H (피리딘이 회수) P(V) 포스포트리에스터 완성 부산물 — pyridinium iodide(피리디늄 아이오다이드) 포스포디에스터 형성 전 2-시아노에틸이 남아 있는 포스포트리에스터 — 디에스터는 PART 3

Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 6 · ATDBio Nucleic Acids Book

Oxidation(산화) 시약 변경에 따른 생성물 변화

같은 단계의 시약 선택에 따른 칩 합성용 · 의약품용 분기

I₂ / H₂O → P=O 포스포트리에스터 (표준)

DDTT · Beaucage(보카주) → P=S 포스포로티오에이트

무수 Oxidation(산화)

tert-butyl hydroperoxide(터트 부틸 하이드로퍼옥사이드) · CSO(캠퍼설포닐 옥사지리딘) — 물·요오드·피리딘을 사이클에 넣지 않음 → 마이크로어레이·칩 합성(DNA Data Storage 6-2)과 green(그린·친환경) 공정에 채택

Sulfurisation(설퍼라이제이션·황화)

DDTT 0.05~0.1 M in 피리딘/아세토니트릴(용액 수명 최대 6개월) 또는 Beaucage(보카주) 시약 → 포스포로티오에이트 골격

의약품으로의 연결

FDA·EMA 승인 ASO 16종 중 11종이 PS + 2′-MOE 조합 · nusinersen은 18-mer PS 2′-MOE로 2016-12-23 FDA 승인 → DNA Data Storage 7-2 XNA·ASO

Oxidation(산화) 후 2차 Capping(캡핑)

일부 합성기는 Oxidation(산화) 직후 Capping(캡핑)을 한 번 더 넣음 — 목적은 잔류 수분 제거(과잉 물이 Ac₂O와 반응해 아세트산이 되고 씻겨 나감)

Glen Research, Glen Report 37-26 (2025/26), Greener Roads Ahead · Nonaqueous Oxidation in DNA Microarray Synthesis, PMC10867803 · Lumiprobe, DDTT Sulfurizing Reagent · Frontiers in Pharmacology 14:1304342 (2023) · Biotage PPS676 (2022) p.5

퀴즈 1 — 4단계 사이클

문항을 선택하면 해답 표시

Capping(캡핑) 생략 시 정제로 제거하기 어려운 오류의 발생 이유

미반응 5′-OH가 다음 사이클에 Coupling(커플링)되어 내부 결손(n−1) 형성 · 길이 차이는 1 nt이고 5′ 말단이 전장 산물과 똑같이 DMT-ON이므로 길이 기반·트리틸 기반 정제 모두 통과함. Capping(캡핑)하면 그 길이에서 truncated(트렁케이티드·절단 산물)(DMT 없음)로 멈추므로 분리 가능해짐

Oxidation(산화) 생략 후 다음 사이클에서 절단되는 결합

Coupling(커플링) 산물은 P(III) 포스파이트 삼중에스터로 산에 불안정함 → 다음 사이클의 3% TCA 탈트리틸 단계에서 골격이 절단됨. Oxidation(산화)로 P(V)가 되면 2-시아노에틸 보호와 함께 이후 사이클의 산 처리를 견딤

Coupling(커플링)의 율속 단계 · DCI가 테트라졸보다 빠른 이유

율속은 ② 테트라졸라이드의 P에 대한 친핵 치환(다이아이소프로필아미노 이탈) · 따라서 속도는 활성화제의 산성도가 아니라 친핵성이 지배함. DCI는 pKa 5.2로 테트라졸(4.8)보다 산성이 약하지만 친핵성이 커서 Coupling(커플링) 속도가 2배이고, ACN 용해도도 1.1~1.2 M로 높음

Oxidation(산화) 직후 인의 정확한 상태

2-시아노에틸로 보호된 포스포트리에스터 P(V) — 포스포디에스터가 아님. 포스포디에스터 음이온은 최종 암모니아 처리에서 β-제거로 시아노에틸이 빠진 뒤에 완성됨

PART 3

절단 · 탈보호 · 가수분해

Cleavage(클리비지·절단), Deprotection(디프로텍션·탈보호), and Water(워터·물)

  • conc. NH₄OH — 숙시닐 에스터 가수분해
  • 2-시아노에틸의 β-제거와 아크릴로니트릴
  • 염기 보호기 — 교과서 조건과 실무 조건의 불일치
  • 물 — 아미다이트 분해 · 완성된 DNA 골격의 높은 안정성

Cleavage and Deprotection — Formation of the Phosphodiester Backbone

암모니아 처리: 숙시닐 에스터 절단과 인산 보호기의 β-제거

conc. NH₄OH · 실온 1시간

conc. NH₄OH 28~33% NH₃ · 실온 1시간 CPG 숙시닐 에스터 C 지지체 분리 3′-OH (지지체에서 분리) O 디옥시리보스 T O P O 다음 잔기 5′-O O CH₂ CH₂ H (산성) C≡N NH₃ 나이트릴의 전자끌기 → β-CH₂의 H가 산성 CH₂=CH–CN 아크릴로니트릴 O⁻ 포스포디에스터 음이온 완성 자연의 DNA 골격과 동일한 결합 형성 최종 산물의 5′·3′ 말단은 모두 자유 OH → DNA Data Storage 8 장기 보존의 주인공

Glen Research, Glen Report 20.24 · Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 7 · 8 · Oligonucleotide synthesis under mild deprotection conditions, PMC10617641

아크릴로니트릴에 의한 염기 알킬화

인산 보호기 탈보호의 부산물 → 티민 N3의 시아노에틸화

생성 시점: 인산 보호기의 탈보호

2-시아노에틸 보호기를 β-제거로 떼는 과정에서 아크릴로니트릴 생성

인산–O–CH₂–CH₂–CN↓ β-Elimination(β-제거)인산–O⁻ + CH₂=CH–CN
Michael acceptor(마이클 수용체)

다른 분자의 친핵성 원자가 결합할 수 있는 활성화된 이중결합을 가진 분자 · 여기서는 아크릴로니트릴

  1. ① β-제거: 보호기 제거

    염기성 탈보호 조건에서 인산의 2-시아노에틸 보호기 제거 → 아크릴로니트릴(CH₂=CH–CN) 방출

  2. ② Michael 부가: 부산물의 결합

    –CN의 전자끌기 효과로 이중결합의 말단 탄소가 친핵성 질소와 반응하기 쉬워짐

  3. ③ 티민 N3의 알킬화

    티민의 N3에 –CH₂–CH₂–CN이 결합 → N3-cyanoethyl-dT 생성 · 염기 수는 유지되지만 티민의 구조가 변형되는 불순물

결과: 질량 약 +53 Da · 장쇄 올리고에서 더 많은 보호기 제거와 부산물 방출

희석

암모니아 부피 증가 → 아크릴로니트릴 농도 감소

포획

AMA의 메틸아민을 부산물 포획제로 이용

사전 제거

절단 전 다이에틸아민 처리 → 시아노에틸 보호기 제거와 세척

Glen Research, Glen Report 21.211: Synthesis of Long Oligonucleotides · 구조식: RDKit · 반응식은 인산 골격의 다른 치환기를 생략한 개념도

염기 보호기별 탈보호 속도와 반응 조건

교과서 도식의 "55 °C 5시간"은 A·C 기준 · dG 기준으로는 부족함

dG 보호기실온55 °C65 °C
iBu-dG (표준)36 h16 h8 h
dmf-dG · Ac-dG16 h4 h2 h
iPr-Pac-dG (ultramild(울트라마일드·초온화 조건))2 h0.5 h—
짚어야 할 불일치

교과서·업체 도식은 conc. NH₄OH 55 °C 5시간(Bz-dA·Bz-dC 기준 관용값) · 그러나 표준 iBu-dG는 55 °C 16시간이 필요함 → 5시간에서 멈추면 dG의 보호기가 남은 불순물이 나옴

  • 표준 조합 — N6-벤조일 dA · N4-벤조일 dC · N2-아이소부티릴 dG
  • ultramild(울트라마일드·초온화 조건) 조합 — N6-페녹시아세틸 dA · N2-아세틸 dC · N2-아이소프로필페녹시아세틸 dG
  • AMA = conc. NH₄OH : 40% 수용성 메틸아민 1:1 (v/v) → 65 °C 5분 · 55 °C 10분 · 37 °C 30분 · 실온 120분 (절단만은 실온 5분)
  • 단 AMA를 Bz-dC와 함께 쓰면 트랜스아미네이션으로 약 5% N4-Me-dC가 생김 → Ac-dC를 반드시 사용
DNA Data Storage 4와의 연결

탈보호가 덜 된 종 · N4-Me-dC · 아크릴로니트릴 부가물은 모두 시퀀싱에서 치환 오류로 읽힘 · 즉 DNA Data Storage 4 Reed–Solomon이 정정해야 할 오류의 일부는 이 화학에서 만들어짐

Glen Research, Glen Report 20.24, Deprotection Volume 1, Table 1 · 2 · Biotage white paper PPS676 (2022) Fig. 8 · 9 · 10

무수 조건이 필요한 이유 — 수분에 의한 효율 저하 두 경로

포스포라미다이트는 가수분해에 약함 · 그래서 수분이 ppm 단위로 관리됨

경로 ① 반응기 안 — 친핵체 경쟁 활성종 phosphorotetrazolide(포스포로테트라졸라이드) 지지체 5′-OH H₂O 이기면 → Coupling(커플링) 성공 이기면 → 모노머 소모 + 단일 뉴클레오사이드 부산물 경로 ② 시약병 안 — 단량체 자체의 분해 포스포라미다이트 H₂O H-포스포네이트 → 병 안 유효 농도가 떨어짐 (0.1 M이 아니게 됨) 현장의 무수 스펙 합성기 아세토니트릴 수분 10~15 ppm 이하 septum-sealed(셉텀 실드·격막 밀봉) 병 · Ar/He도 인라인 건조 필터 통과 습한 여름철 효율 저하 실측 · 극단적으로는 합성기를 덮고 제습기 가동 오래 세워둔 합성기는 라인이 마를 때까지 처음 몇 개 올리고 품질이 나쁨
  • 활성종은 친핵체를 가리지 않음 — 5′-OH와 물이 같은 인 원자를 두고 경쟁함 · 물이 이긴 사슬은 그 사이클에서 결손
  • 사이클 시간의 상당 부분이 세척과 아르곤 플러시인 이유도 여기에 있음 — 이전 단계의 물(④ 산화의 H₂O)을 반드시 제거해야 함
그래서 나온 설계

③ Capping(캡핑)을 Oxidation(산화) 뒤에 한 번 더 넣는 합성기가 있는 이유 = Ac₂O가 잔류 수분을 아세트산으로 바꿔 씻어내기 때문(PART 2)

Glen Research, Glen Report 21.211, Synthesis of Long Oligonucleotides · Biotage white paper PPS676 (2022) p.5

인산 골격의 가수분해 안정성과 DNA 열화

물 — 아미다이트 분해 · 완성된 포스포디에스터의 높은 안정성

완성된 P(V) 포스포디에스터 음이온

dineopentyl phosphate(다이네오펜틸 포스페이트) 음이온의 반감기 3,000만 년(25 °C) · 포스포디에스터 P–O 절단 속도상수 상한 약 10⁻¹⁵ s⁻¹ · staphylococcal nuclease(스타필로코컬 뉴클레이스)(kcat 95 s⁻¹)는 약 10¹⁷배 가속

물에 의한 열화 경로의 반감기 (대수 축 · 속도상수에서 ln2/k 환산) 1일100년10⁵년10⁸년 P–O 가수분해 3×10⁷ 년 depurination(디퓨리네이션) 약 92년 (k = 2.4×10⁻¹⁰ s⁻¹, pH 7.1 · 37 °C) Apurinic/apyrimidinic site(무염기 자리) 약 47일 (1.7×10⁻⁷ s⁻¹) — 탈퓨린화보다 약 700배 빠른 절단
저장 수명의 병목 — P–O 가수분해보다 탈퓨린화

퓨린 이탈(율속) → Apurinic/apyrimidinic site(무염기 자리)의 후속 자동 절단 · 즉 DNA 데이터 저장의 수명은 depurination(디퓨리네이션·탈퓨린화)에 의해 결정

DNA 보존 조건 — 건조 · 저온 · 캡슐화

83 kB를 158 nt 4,991 조각으로 부호화하고 실리카 캡슐화 후 70 °C 1주 처리에도 무오류 복원 = 중부유럽 상온 약 2,000년 등가 · 영구동토 온도면 약 100만년 외삽

Schroeder GK, Lad C, Wyman P, Williams NH, Wolfenden R, PNAS 103(11):4052 (2006) · An R et al., PLOS ONE 9(12):e115950 (2014) · Mechanistic studies on depurination and apurinic site chain breakage, Nucleic Acids Res. 22(23):4997 (1994) · Grass RN, Heckel R, Puddu M, Paunescu D, Stark WJ, Angew. Chem. Int. Ed. 54:2552 (2015)

PART 4

수율과 길이 · 환경

Why 200 nt Is the Wall(200 nt가 한계인 이유)

  • 전장 수율 = (커플링 효율)n−1
  • 200-mer는 199회 Coupling(커플링) — 평균 1곳 실패가 곧 수율 37%
  • 길이를 막는 네 가지 부산물과 지지체의 한계
  • 폐기물 · 용매 · 2026년에 바뀌고 있는 것

Coupling(커플링) 효율에 따른 길이 한계

한 칸의 성공률이 지수로 올라감 · 200-mer는 199회 Coupling(커플링)

FLP (%) = (커플링 효율)n − 1 × 100 n = 올리고 길이 · 200-mer → 199회 Coupling(커플링)
Coupling(커플링) 효율10-mer20-mer50-mer100-mer150-mer200-mer
99.5% (시약이 순수할 때 도달 가능)95.6%90.9%78.2%60.9%47.4%36.9%
99.0%——61%——약 13%
98.5% (쉽게 달성되는 수준)———22.4%—4.9%
97%———4.9%—0.2%
95%———0.6%——
  • 상용 실측 — IDT 표준 DNA 올리고 99.4%(20-mer 89.2% · 50-mer 74.5%) · Ultramer 99.6%(200염기 전 구간 평균 >99.5%)
  • 같은 효율이라도 길이가 지수를 키움 — 98%에서 20-mer 68% vs 100-mer 13%
  • 칠판 계산 — 199 × log 0.995 ≈ −0.433 → 10−0.433 ≈ 0.37 · 계산기 없이 37%가 나옴
평균 실패 횟수와 전장 수율

99.5%에서 200-mer 한 분자당 평균 실패 Coupling(커플링) = 199 × 0.005 ≈ 1회 · 즉 "평균 한 곳 실패"가 곧 전장 수율 37%

ATDBio Nucleic Acids Book · Biotage white paper PPS676 (2022) yield table · IDT, Oligonucleotide synthesis: Coupling efficiency and quality control · Glen Research, Glen Report 21.211 · Palluk S et al., Nat Biotechnol 36:645 (2018)

올리고뉴클레오타이드의 길이 제한 요인

한계는 한 가지 이유가 아니라 네 경로의 합

부산물어느 단계에서원인5′ 말단정제 가능성
Truncated(절단 산물) · 3′ 절단① Detritylation(탈트리틸화)Depurination(탈퓨린화) → Apurinic/apyrimidinic site(무염기 자리) → 탈보호 시 절단DMT-ON매우 어려움
내부 결손 n−1③ Capping(캡핑) 불완전미반응 5′-OH가 다음 사이클에 붙음DMT-ON매우 어려움
n+1② Coupling(커플링)강한 산성 활성화제 → dG 아미다이트 GG 이량체DMT-ON어려움
단순 결손 (캡핑됨)③ Capping(캡핑) 성공수분·모노머 품질 저하로 Coupling(커플링) 실패 → 아세틸 봉인DMT-OFF가능

위의 세 부산물은 DMT-ON — 전장 산물과 동일한 말단 보호기로 트리틸 기반 분리 곤란

  • 지지체의 한계 — 100 nt 초과는 2000 Å CPG 권장 · 로딩이 10~20 µmol/g으로 낮고 입자가 부서지기 쉬워 3′ 결손을 유발
  • 누적 손상 모형 — 염기당·사이클당 손상 확률 0.02% 가정 · 200-mer의 누적 노출 200×199/2 ≈ 2만 회 → 0.999820000 ≈ 1.8% · Coupling(커플링) 효율 100%에서도 남는 손상 한계
  • 상용 제공 범위 — IDT Ultramer DNA 제공 범위 45~200 nt · ESI-MS QC도 200염기까지
DNA Data Storage 5와의 연결

프라이머 + 인덱스 + 데이터 + ECC의 총 길이 ≤ 200 nt · 합성 한계 내 페이로드 배분

세 가지 귀결

① 실용 한계 약 150~200 nt
② 더 긴 DNA는 짧은 올리고를 조립(DNA Data Storage 7-1)
③ 한계를 넘으려면 다른 원리 → TdT(DNA Data Storage 7-1)

Glen Report 21.211 · Biotage PPS676 (2022) · Palluk S et al., Nat Biotechnol 36:645 (2018) · IDT, Ultramer DNA Long Oligos

폐기물 · 용매 — 2026년 공정 변화

보호기를 매 사이클 버리는 구조가 원리적 한계를 만듦

atom economy(애텀 이코노미·원자 경제성)

고상 올리고 합성(SPOS) 평균 약 36%

사이클당 폐액

3~5 mL (장비·조건에 따라)

연간 유해 폐기물

전 세계 올리고 수요로 >30만 갤런(약 113만 L)

단량체 소모

1.0 µmol 규모에서 과잉 아미다이트 약 7~8 mg

단계표준 조건2026년에 바뀌고 있는 것
① Detritylation(탈트리틸화)3% TCA in 디클로로메탄3% DCA in Toluene(톨루엔)(Glen 40-4240) — DCM 제거 · 단 전도도식 trityl(트리틸) 모니터와 비호환
② Coupling(커플링)0.5 M 1H-테트라졸DCI 표준화 — 속도 2배 · 장쇄에서 n+1 억제
④ Oxidation(산화)0.015 M I₂ / H₂O / 피리딘CSO 무수 Oxidation(산화) — 물·요오드·피리딘을 사이클에서 제거
세척아세토니트릴 30 s × 사이클 수아세토니트릴 재활용
원리적 한계

5′-DMT · 염기 보호기 · 인산 보호기를 매 사이클 버림 → atom economy가 본질적으로 낮음 · 시약을 바꾸는 개선만으로는 넘을 수 없음 → ligation(라이게이션·연결) 기반 조립과 효소 합성이 대안으로 제시됨(DNA Data Storage 6-2 · DNA Data Storage 7-2)

Glen Research, Glen Report 37-26 (2025/26), Greener Roads Ahead · Enzymatic de novo oligonucleotide synthesis, Biotechnol Adv (2025), doi:10.1016/j.biotechadv.2025.108604 · 화학 합성 단량체 농도 약 0.1 M vs 효소 합성 0.001~0.01 M

DNA 화학 합성의 핵심 원리

사이클 한 칸의 화학이 길이 · 수율 · 정제 가능성을 모두 결정

  1. Capping(캡핑) 생략에 따른 정제 제거 곤란 오류 — 미반응 5′-OH를 살려두면 내부 결손 n−1이 되고, 전장 산물과 똑같이 DMT-ON이라 정제로 걸러지지 않음 · Capping(캡핑)은 오류를 없애는 것이 아니라 분리 가능한 형태로 바꾸는 장치
  2. 골격 안정을 위한 Oxidation(산화)의 필요성 — Coupling(커플링) 산물 P(III)는 산에 불안정해 다음 사이클 TCA에서 골격이 끊어짐 · 그리고 Oxidation(산화) 산물은 포스포디에스터가 아니라 시아노에틸 보호된 포스포트리에스터
  3. 200-mer의 수율 지수 — 199 — FLP = (효율)n−1 · 99.5%에서 평균 실패 Coupling(커플링)이 약 1회이고 그것이 곧 전장 수율 36.9% · 반복 횟수 증가에 따른 전장 수율의 지수적 감소
오늘의 한 문장

화학 합성 — 반응점 1개 유지 · 수분 배제 / 완성된 포스포디에스터 — 높은 가수분해 안정성

강의 전 예습 · 결석 보충

ATDBio Nucleic Acids Book — Solid-phase oligonucleotide synthesis(고상 올리고뉴클레오타이드 합성) (사이클 표 · 메커니즘 도식 · 수율 표가 한 페이지에 정리되어 있음)

ATDBio Nucleic Acids Book · Biotage white paper PPS676 (2022) · Glen Research, Glen Report 20.24 · 21.211 · 37-26

퀴즈 2와 과제

문항을 선택하면 해답 표시

Coupling(커플링) 효율 99.0% · 150-mer의 전장 수율 계산과 풀이

149 × log 0.99 ≈ 149 × (−0.004365) ≈ −0.650 → 10−0.650 ≈ 0.22 → 약 22% · 같은 효율에서 50-mer는 61%, 200-mer는 약 13%

수용액 냉장 보관 중 올리고 절단 — 인산디에스터 가수분해 여부 판단

아님. 포스포디에스터 P–O 절단은 반감기가 3,000만 년 수준(속도상수 ≤ 10⁻¹⁵ s⁻¹)으로 사실상 일어나지 않음 · 실제 경로는 depurination(디퓨리네이션·탈퓨린화)(퓨린 1개 반감기 약 92년, pH 7.1 · 37 °C) → Apurinic/apyrimidinic site(무염기 자리) → β-제거 절단(약 47일)임 · 그래서 건조·저온·캡슐화가 보존의 핵심

수분에 약한 아미다이트 · ④ Oxidation(산화) 단계의 물 사용이 가능한 이유

물이 들어가는 시점의 인은 이미 P(III) 포스파이트이고 활성화된 아미다이트가 아님 · Oxidation(산화)가 끝난 뒤에는 아세토니트릴 세척과 아르곤 플러시로 물을 제거하며, 일부 합성기는 Oxidation(산화) 후 2차 Capping(캡핑)으로 잔류 수분을 아세트산으로 바꿔 씻어냄 · 물을 아예 넣지 않으려면 CSO·t-BuOOH 무수 Oxidation(산화)를 씀

과제

① 99.4%와 99.6%에서 200-mer 전장 수율을 각각 계산하고 차이를 논하라 ② 4단계 사이클을 시약·농도·시간·전자 이동·부반응의 다섯 항목 표로 재구성하라

심화 과제

Oxidation(산화) 시약의 DDTT 교체 — 생성물 구조 · 정제상의 차이 · 승인 ASO의 해당 골격 사용 이유 조사(DNA Data Storage 7-2 예습)

화학 합성과 DNA 보존의 수분 관리

DNA Data Storage 6-1: 컬럼 1개 위의 화학 — 4단계 합성 사이클과 사슬 길이 제한
DNA Data Storage 6-2: 같은 화학을 칩 위에서 100만 개 동시에 · 그리고 보호기를 쓰지 않는 효소 합성(TdT)
DNA Data Storage 7-1: 오늘 만들어진 truncated(트렁케이티드·절단 산물) · n−1 · n+1을 실제로 분리하는 방법 — 정제와 HPLC

Q and A(질의응답)

참고 영상 — 고체상 합성의 복습과 심화

첨부 자료 · 교토대 공개강의와 보호기·부반응 심화 해설

Unit 3 Part 3 Synthesizing DNA by Solid Phase Synthesis

Kyoto-U OCW (8:37)YouTube에서 보기 ↗

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관찰할 내용

복습 — 교토대 공개강의 '생명의 화학' 고상 합성 편

개념 연결

  • 고체상 합성 원리의 복습
  • 보호기·부반응·절단 과정의 심화 학습

영상: Kyoto-U OCW · the bumbling biochemist · YouTube 제목·제작자 확인: 2026-10-07