HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

HPLC의 원리

제1강 (60분 통합)

크로마토그래피 기초 · 주입부 · 컬럼 ｜ 이동상 · 완충용액 · 첨가제
송영준 Youngjun Song, Ph.D. · 인천대학교

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학습목표

크로마토그래피의 원리에서 이동상 설계까지

  • 크로마토그래피·크로마토그래프·크로마토그램 구분과 정성·정량분석 원리
  • GC와 HPLC의 차이 — 이동상, 머무름 조절, 분석 대상
  • 송달부·분리부·검출부와 6-port 밸브 주입 원리
  • C18 역상 컬럼의 구조, 정지상 화학, 입자 크기의 영향과 관리법
  • 정상/역상에서 용매 극성과 용리 세기의 관계
  • 등용매 용리와 기울기 용리의 선택 기준
  • pKa·Henderson–Hasselbalch 식으로 분석물질의 이온화 예측
  • 완충용액의 종류·농도·취급, 첨가제와 희생 염기의 역할
HPLC의 원리 — 한 문장

분리 = 정지상(C18)과 이동상 사이의 분배 · 실무의 손잡이 = 이동상의 극성(조성)과 pH(완충용액·첨가제)

Contents

전반 = 기기와 컬럼 / 후반 = 이동상 설계

PART 1

크로마토그래피 기초

PART 2

HPLC 시스템과 용리

PART 3

시료 주입부

PART 4

컬럼

PART 5

컬럼 관리와 사용법

PART 6

이동상

PART 7

pH · 완충용액 · 첨가제

전반 · 기기의 구성과 컬럼 (영상 1~5)

후반 · 이동상 설계 (영상 6~8)

진행 순서

전반 (PART 1~5) · 퀴즈 1 · 후반 (PART 6~7) · 퀴즈 2 · 정리

PART 1

크로마토그래피 기초

Chromatography Basics

  • 크로마토그래피는 무엇으로 물질을 나누는가
  • 정성분석과 정량분석은 어떻게 다른가
  • GC 대신 HPLC를 쓰는 이유는 무엇인가

용어 정리 — -graphy · -graph · -gram

이동상 + 정지상 = 분리

6,000 psiHPLC (High Performance LC)
처음 이름은 High Pressure LC
→
15,000 psiU(H)PLC (Ultra High Performance LC)
입자 더 작게 · 압력 더 높게
액체LC = 이동상이 액체
기체이면 GC
  • Chromatography — 기법·학문 자체 (-graphy)
  • Chromatograph — 분석 장비 (gas chromatograph, liquid chromatograph)
  • Chromatogram — 결과 그래프 · x축 머무름 시간(min) · y축 신호 크기
Chromatogram (결과 그래프) 머무름 시간 (min) 신호 크기 피크 1피크 2
HPLC의 유래

컬럼에 정지상을 채우고 이동상을 흘리는 컬럼 크로마토그래피에 압력을 세게 가했더니 분리가 훨씬 좋아짐 → High Pressure → High Performance

정성분석과 정량분석

표준물질의 머무름 시간으로 '무엇', 피크 면적으로 '얼마나'

4.5분7.4분 성분 A 표준물질 성분 B 표준물질 미지 시료 머무름 시간 (min) →
  • 정성분석 — 표준물질과 미지 시료를 동일 조건에서 분석
    • 표준 A 4.5분, B 7.4분 → 미지 시료의 4.5분·7.4분 피크 = A, B
  • 정량분석 — 피크 면적(또는 높이) 비교
    • 20 ppm 표준 면적 20 → 미지 시료 면적 12 → 12 ppm
    • 성분마다 검출기 감도가 달라 같은 농도라도 면적이 다름
미지 시료 농도 감응값 농도감응 y = ax + b
검정곡선 (calibration curve)

x축 농도, y축 감응 · 여러 농도를 찍어 최소제곱법으로 y = ax + b · 미지 시료의 감응값 → 농도 · 정량 전에 반드시 정성이 선행

GC vs. HPLC

이동상이 다르면 머무름 조절 방법과 분석 대상이 달라진다

기기이동상머무름 조절분자량휘발성극성도열적 안정성
GC기체컬럼 온도 (실온 ~ 330 ℃)낮은 것 (약 300 이하)높은 것만비극성안정한 것만
HPLC액체이동상 조성 (극성도)낮은 것 ~ 높은 것낮은 것도 가능극성 · 비극성불안정한 것도 가능
  • GC는 주입구·컬럼·검출기가 200~300 ℃ → 그 온도에서 휘발하고 열에 안정한 화합물만 분석
  • HPLC는 상온 부근에서 작동 → 비휘발성·열에 불안정한 물질, 분자량이 큰 물질도 분석
결론

유기화합물 중 HPLC가 커버하는 범위가 GC보다 훨씬 넓다 · 그래서 실험실에는 GC보다 HPLC가 훨씬 많다

PART 2

HPLC 시스템과 용리

System & Elution

  • 기기는 어떤 세 부분으로 되어 있는가
  • 왜 어떤 물질은 빨리, 어떤 물질은 늦게 나오는가
  • 머무름 시간은 무엇으로 조절하는가

HPLC 기기의 구성

송달부 · 분리부 · 검출부

흐름 — 이동상 용매 → 펌프 → 주입구 → 컬럼 → 검출기 → 폐용매

송달부 분리부 검출부 이동상 용매 펌프 주입구 시료 HPLC 컬럼 검출기 컴퓨터 시스템 폐용매 AB BA

  • 송달부 — 펌프가 이동상을 밀어 주입구로 보냄
    • 액체는 가만히 두면 흐르지 않으므로 펌프가 필수
  • 분리부 — HPLC 컬럼에서 성분 분리
  • 검출부 — 검출기 → 컴퓨터, 이동상은 폐용매로
흐름

이동상 용매 → 펌프 → 주입구(시료 합류) → 컬럼(분리) → 검출기(피크) → 폐용매

왜 머무름 시간이 다른가

비극성 정지상(C18)에서 용질의 극성도 차이 — like dissolves like

비극성 정지상 이동상 흐름 ↓ A B BA 머무름 시간 → ● 비극성 물질 A ■ 극성 물질 B ▼ 이동상 · 어느 순간 A는 정지상 6 : 이동상 4, B는 정지상 3 : 이동상 7
핵심 문장

용질이 정지상보다 이동상에 더 많이 분배되어 있으면 → 머무름 시간은 짧아진다 · 비극성 물질 A는 C18에 붙잡혀 늦게, 극성 물질 B는 이동상에 실려 먼저

머무름 시간은 어떻게 조절되는가

용매 분자(◆)와 용질 분자(●)가 정지상을 두고 경쟁한다

용매–용질 경쟁과 머무름 시간

비극성 정지상 (C18) 극성 이동상 비극성 이동상 0369 min 머무름 시간 7.0분 5.0분

  • 극성 이동상 — 비극성 정지상에 침투 못 함 → 용질이 정지상에 남음
  • 비극성 이동상 — 정지상에 파고들어 용질을 밀어냄 → 이동상 쪽 분배 증가
    • 예: 극성 이동상에서 7.0분 → 비극성으로 바꾸면 5.0분
  • 용리 서열 — 흡착제에서 용질을 치환시키는 용매의 상대적 능력
역상(C18)의 규칙

용매의 극성 감소 → 용리액 세기 증가 → 용질은 컬럼에서 더 빨리 용리 · 물:메탄올 = 70:30이면 극성↑ 머무름↑, 30:70이면 극성↓ 머무름↓

역상 크로마토그래피에서 이동상 용매의 영향

극성도 순서 = 용리 세기의 역순

↑ 극성도 증가 · 용리 세기 감소 ↓ 극성도 감소 · 용리 세기 증가 WaterMethanolIsopropanolAcetonitrile AcetoneEthyl AcetateEthyl EtherTetrahydrofuran Methylene ChlorideChloroformCarbon TetrachlorideIsooctaneHexane 붉은색 = 역상에서 흔히 쓰는 용매

역상 HPLC의 실제 이동상

물 + 메탄올 / 아세토나이트릴 / THF

물이 가장 극성(용리 세기 최소) · 유기용매 비율을 올릴수록 빨리 나온다

실험실 표기: MeOH · ACN · THF · IPA · EA · MC

왜 서열을 알아야 하나

같은 분리를 메탄올 대신 ACN이나 THF로 옮길 때, 그리고 기울기 용리 설계에서 어느 용매가 '센' 용매인지 알아야 한다 (PART 6)

PART 3

시료 주입부

Injector

  • 어떤 상태로, 얼마나, 어떤 농도로 주입하는가
  • 6-port 밸브는 어떻게 정확한 부피를 넣는가
  • 바이알·인서트·오토샘플러

주입 조건 — 상태 · 양 · 농도 · 용매

액체 시료를, 아주 조금, 이동상과 섞이는 용매에 녹여서

10–20 µLHPLC 주입량
컬럼 dead volume의 1~5 %
1–5 µLUPLC 주입량
아주 소량으로 충분
1–100 µg/mLUV/Vis 검출 적정 농도
= 1~100 ppm
  • 액체 시료 — 분석물질이 용매에 녹은 용액 상태로 주입 · HPLC는 물에 녹여도 됨 (GC는 불가)
  • 농도 — 1 ppm 이하는 검출이 어렵고, 100 ppm 초과는 피크 정점이 잘림(overload) → 정량·정성 모두 불가
  • 시료 용매 — 이동상과 잘 섞이는 용매 (역상: 물·메탄올·아세토나이트릴) · 에테르에 녹이면 이동상에 떠서 분리 실패
1~100 ppm · 가우시안 100 ppm 초과 · overload 정점 잘림 정량·정성 가능정량·정성 모두 불가
실무 팁

수돗물처럼 깨끗한 수용액 시료는 필터만 하고 그대로 주입 가능 · 시료는 가능하면 이동상 자체에 녹이는 것이 가장 좋은 피크를 준다

6-port 밸브 — 시료 적재와 주입

루프 부피가 주입량을 결정한다

6-port 밸브의 두 상태

(a) 시료 적재 loading 밸브 회전 (b) 시료 주입 inject 시료 (주사기 25 µL) 폐기 컬럼 이동상 (펌프) 시료 루프(20 µL) 123456 시료 20 µL → 컬럼 시료 25 µL 중20 µL만 루프에나머지는 폐기 이동상이 루프를통과하며 시료를컬럼으로 밀어냄

  • (a) 시료 적재 loading — 이동상은 4→5→컬럼으로 흐름
    • 루프가 20 µL면 주사기로 25 µL를 1번 포트에 주입 → 20 µL만 루프에, 나머지는 폐기
  • (b) 시료 주입 inject — 밸브를 돌리면 이동상이 4→3→루프 통과
    • 루프 속 시료를 밀어 6→5→컬럼으로 보냄
  • 수동 주입이든 오토샘플러든 원리는 같다
왜 루프보다 많이 취하나

루프를 완전히 채워야 주입 부피가 재현된다 · 항상 루프 부피보다 넉넉히 취해 넘치는 양은 폐기시킨다

바이알 · 인서트 · 오토샘플러

시료가 적을 때와 자동 주입

0.51.01.5 샘플 바이알보통 1.5 mL 인서트~200 µL 인서트시료가 적을 때 (생체 시료) 0102025 µL 수동 주입 주사기 (25 µL) 프로그램주입량 20 µL바이알 위치 · 순서 오토샘플러기계 주사기가 정해진 바이알에서 샘플링 · 주입
  • 샘플 바이알 — 보통 1.5 mL
  • 인서트 — 시료가 200 µL 정도로 적을 때(생체 시료) 바이알 안에 끼우는 뾰족한 유리관
    • 없으면 바닥에 깔려 오토샘플러가 취하지 못함
  • 오토샘플러 — 프로그램에 주입량 입력 → 기계 주사기가 샘플링·주입
요즘의 표준

대부분 오토샘플러 사용 · 수동 주입(25 µL 주사기)도 원리는 동일

퀴즈 1 — 기초 · 주입부 확인

옆 사람과 대화 후 답변 · 번호를 클릭하면 힌트

같은 농도의 A와 B를 주입했는데 피크 면적이 다르다. 정량은 어떻게 해야 하는가?
힌트 — 검출기 감도는 성분마다 다름 · 성분별 검정곡선
역상(C18)에서 물:메탄올을 70:30에서 30:70으로 바꾸면 머무름 시간은 어떻게 되는가?
힌트 — 극성 감소 → 용리 세기 증가
20 µL 루프에 시료를 정확히 20 µL만 넣으면 안 되는 이유는?
힌트 — 루프를 완전히 채워야 재현성 · 넘치는 양은 폐기
PART 4

컬럼

The Column

  • 컬럼은 어떻게 생겼는가
  • 정지상은 실리카 위에 어떻게 만들어지는가
  • 입자 크기는 무엇을 바꾸는가

컬럼의 형태

내경 2.1~4.6 mm · 입자 1.8~5 µm · 길이 50~300 mm

내경 2.1~4.6 mm입자 1.8~5 µm 단면 알루미늄 재킷 보호 컬럼 주 컬럼 (스테인리스 강철) 다공성 타이타늄 프릿 다공성 타이타늄 프릿 출구입구 길이 50~300 mm
  • 재질 — 스테인리스 강철(대부분) 또는 플라스틱
  • 분석 컬럼 vs 분취(prep) 컬럼 — 분취는 많은 양을 주입해 fraction으로 구획(천연물 화학)
  • 구조 — 입구 쪽 보호 컬럼, 양 끝 다공성 타이타늄 프릿, 주 컬럼, 알루미늄 재킷
가장 흔한 분석 컬럼

C18 (ODS, octadecyl silica) 역상 컬럼 · 4.6 × 150~250 mm, 5 µm

제조사에 따른 C18 컬럼의 파라미터

설명서에서 반드시 확인할 것 — pH 범위, 입자·기공 크기, 탄소 적재량

입자 크기

µm

기공 크기

Å

표면적

m²/g

온도 한계

℃

pH 범위

가장 중요

끝 씌우기

end-capping

탄소 적재량

%

새 컬럼 설명서에 적힌 항목 · 같은 C18이라도 제조사(Symmetry, Luna, Zorbax, Hypersil, YMC ODS)마다 값이 다르다

  • 이름은 제조사마다 다름 — Symmetry, Luna, Zorbax, Hypersil, YMC ODS
  • ODS = octadecyl silica = C18
  • pH 범위가 가장 중요 (뒤에서 설명)
  • 끝 씌우기(end-capping), 탄소 적재량(%)
왜 pH 범위인가

실리카 기반 정지상은 이동상 pH가 범위를 벗어나면 녹거나(염기성) 실란올이 해리되어 꼬리끌림(산성)을 만든다

정지상 (Stationary Phase)

고체 지지체 = 고순도 · 구형 · 미공성 실리카 입자

고순도 · 구형 · 미공성 실리카 입자 표면 실란올 Si–OH1 m²당 최대 8 µmol 노출 실란올 변형(modify) → 정지상 SiSiSiSiSi OOOO OHOHOHOH OSi(CH₃)₂–C₁₈H₃₇ 잔류 실란올 이동상 pH 023814 Si–O⁻ 해리 → 꼬리끌림 안전 · pH 약 3~8 실리카 용해 → 고분자 지지체
  • 실리카 표면 — 1 m²당 최대 8 µmol의 실란올(Si–OH) 노출
  • pH 8 이상 — 실리카가 해리(용해) → pH 8~12 염기성 화합물은 폴리스티렌 같은 고분자 지지체
  • pH 2~3 — 실란올이 Si–O⁻로 해리 → 노출된 기가 꼬리끌림(tailing) 유발
  • 실란올을 변형(modify)해 원하는 정지상을 만든다 · 실리카 = 지지체, 붙인 것 = 정지상
안전한 이동상 pH

실리카 기반 컬럼은 pH 약 3~8 (제조사 표기 2.0~7.5) 범위에서 사용 · 피크는 가우시안이어야 정량·정성이 정확

실리카 표면과 두 종류의 크로마토그래피

흡착 vs 액체-액체 분배

SiSiSiSiSiSiSiSiSi OOOOOOOOOOOOO OHOHOHOHOH 제미날 (geminal)수소결합한 인접 (vicinal)고립 (isolated) 실리카 입자 표면 실록산 결합 Si–O–Si (내부) Si–OH = 실란올

흡착 크로마토그래피

실리카 입자 표면의 Si–OH와 직접 상호작용 · 유기합성·천연물 화학의 오픈 컬럼

액체-액체 분배 크로마토그래피

실리카 표면의 실란올기에 붙인 정지상(C18 등)에서 분배 · 일반적인 HPLC 조건

실란올의 종류

고립(isolated) · 수소결합한 인접(vicinal) · 제미날(geminal) 실란올과 실록산 결합 — 결합되지 않고 남은 잔류 실란올이 PART 7의 '첨가제' 문제로 이어진다

결합 정지상의 제조와 종류

Si–OH + ClSi(CH₃)₂R → Si–O–Si(CH₃)₂R · R기가 극성을 결정

SiOH + ClSiR CH₃CH₃ − HCl SiOSiR CH₃CH₃ 결합정지상 실리카 표면
극성 정지상 (R = 극성기)비극성 정지상 (R = 탄화수소)
AminoOctadecyl (C18) · R = (CH₂)₁₇CH₃
CyanoOctyl (C8) · R = (CH₂)₇CH₃
DiolPhenyl
정지상의 소수성 감소 / 극성 증가 C18C8C4CyanoPhenylAmino 정지상의 종류 비극성 분석 물질의 머무름 증가
  • 극성 정지상 — Amino, Cyano, Diol
  • 비극성 정지상 — Octadecyl(C18), Octyl(C8), Phenyl
  • C18 > C8 > C4 > Cyano > Phenyl > Amino 순으로 소수성 감소 · 극성 증가
    • 비극성 분석물질은 C18에서 머무름 최대, Amino·Phenyl에서 빨리 나옴
참고

정지상은 실험실이 아니라 제조사가 만들어 판매한다

전형적인 역상 정지상 — C18 컬럼의 구조

분석물질의 비극성 부분과 C18 사슬의 소수성 상호작용

고체 지지체 (실리카) SiSiSiSiSiSi OOOOO OHOHOH OOO Si(CH₃)₂Si(CH₃)₂Si(CH₃)₂ C₁₈ 정지상탄소 18개 사슬 잔류 실란올 고체 지지체 SiO Si(CH₃)₂ 극성 부분 분석 물질 비극성 부분 = 고리 C₁₈ 소수성 상호작용
  • 고체 지지체(Si)에 탄소 18개 사슬을 결합
  • 분석물질의 비극성 부분이 C18과 소수성 상호작용 → 머무름
  • 결합되지 않은 OH(잔류 실란올)도 남아 있다
연결

잔류 실란올은 염기성 화합물과 2차 상호작용 → 꼬리끌림 · 해결책은 pH 조절과 희생 염기(PART 7)

입자 크기의 영향

작은 입자 = 고효율, 그러나 고압력

(a) 10 µm silica(b) 5 µm silica 시간 →시간 → 검출기 신호 주입주입 분해 산물 선속도 u → 이론단 높이 H 5 µm3.5 µm1.8 µm van Deemter 입자 크기 dp (µm) — 작아질수록 → 10531.8 압력 Δp ∝ 1/dp²효율 N ∝ 1/dp 입자 ↓ → 효율 ↑ · 압력 ↑
  • 10 µm → 5 µm: 숨어 있던 분해 산물 피크가 분리됨
  • 전형적인 입자 크기 3~10 µm · 일반 HPLC 최대 약 6,000 psi (≈ 400 기압)
van Deemter

흐름 속도가 높아도 입자가 작을수록 이론단 높이가 작게 유지 → 분리능 증가

PART 5

컬럼 관리와 사용법

Column Care

  • 세정은 얼마나, 무엇으로 하는가
  • 컬럼이 이상하다는 신호는 무엇인가
  • 보관·취급·효과적 사용 체크리스트

컬럼의 세정

컬럼 내 이동상 부피의 20배 · 이동상 부피 = 총 부피의 절반

컬럼 내 총 부피내경 × 길이로 계산
× ½
컬럼 내 이동상 부피총 부피의 절반
× 20
세척 부피이동상 부피의 20배
예 · 컬럼 크기 (mm)총 부피 (mL)이동상 부피 (mL)세척 부피 (mL)1 mL/min
2.1 × 2500.90.4510약 10분
  • 예 2.1 × 250 mm: 총 0.9 mL → 이동상 0.45 mL → 세척 10 mL
    • 1 mL/min이면 약 10분
  • 세척 용매 — 물:메탄올 50:50 또는 30:70 · 완충염은 물에만 녹는다
  • 실리카·극성 결합형(cyano, amino) — 물 금지 · 헥세인을 분자체(molecular sieve)로 건조해 사용
  • 보관은 제조사가 채워 보낸 용매(IPA, 메탄올)로
왜 세정이 중요한가

컬럼은 60~100만 원 이상, 비싼 것은 400~500만 원 · 완충용액을 쓰면 정지상에 염이 남아 컬럼을 망가뜨림 → 실험 후 워싱으로 반드시 제거

컬럼의 이상 징후와 보관

초보자가 놓치는 신호들

이상 징후

  • ✓ 피크 모양이 찌그러짐 (꼬리끌림·갈라짐)
  • ✓ 머무름 시간 변화 (7.0분 → 6.2분)
  • ✓ Backpressure 급증 (3,000 → 4,500 psi)
  • ✓ 피크 분리가 안 됨
  • ✓ Ghost peak 출현

보관

  • ✓ 실온 보관 — 냉장고·오븐 금지
  • ✓ 몇 시간~하룻밤: 직전 용매 그대로
  • ✓ 2일~1주일: 정제수로 워싱 (미생물·곰팡이 방지)
  • ✓ 장기: 물 50 % 이상 안 되는 용매(70 % MeOH)로 채움
  • ✓ end plug를 손으로 단단히 — 용매 휘발 방지
취급

떨어뜨리거나 충격 금지 · 권고 압력 한계 내 작동 · 규격에 맞는 너트·페룰·피팅만 · end fitting은 렌치 대신 손으로

컬럼의 효과적인 사용법

체크리스트 10

  1. 이동상 흐름이 화살표 방향과 일치하도록 설치
  2. 이동상은 탈기(degassing) + 0.45 µm 필터
  3. 보관 용매(IPA)와 호환되는 이동상으로 평형(equilibration) · 5~10배 부피
  4. 잔류 완충제·이온쌍 시약 제거 후 보관 — 염 석출 방지
  5. 실리카 컬럼 사용 pH 2.0~7.5
  1. 이동상 변경은 극성도가 점진적으로
  2. 과도한 압력 → reverse flush
  3. 모든 시료는 0.45 / 0.2 µm 필터 후 주입
  4. 주입구와 본 컬럼 사이에 guard 컬럼 — 소모품, 1~2달마다 교체, 본 컬럼과 같은 C18
  5. 시료는 이동상에 녹이는 것이 최선 · 불가하면 극성도 유사 용매
PART 6

이동상

The Mobile Phase

  • 용매는 어떤 등급을, 어떻게 다루는가
  • 정상과 역상에서 '센 용매'는 무엇인가
  • 등용매 용리와 기울기 용리는 언제 쓰는가

용매 (Solvent) — 등급 · 필터 · 탈기

컬럼 손상과 UV 바탕신호를 막으려면

용매 거름장치 0.45 µm 막 트랩 진공펌프 유기용매용 / 수용액용 필터 구분진공 시 트랩 필수 (펌프 보호) HPLC grade HPLCgradeACN · MeOH 물은 3차 정제수컬럼 손상 방지 · UV 바탕신호 감소 탈기 (degassing) He 기체 방울 — 필터 · (가열) · He 디개싱용존 O₂·N₂ 제거 → 펌프 기포 방지
  • HPLC grade 용매 · 물은 3차 정제수
    • 컬럼 손상 방지 + UV 바탕신호 감소
  • 용매 거름장치로 필터 — 유기용매용/수용액용 필터 구분, 진공 시 트랩 필수
  • 기체 방울 — 필터, (가열), He 디개싱으로 제거
  • 컬럼 세척은 평상시 사용 용매로
역상 재평형

초기 용매로 빈 컬럼 부피의 10~20배를 통과 · 재평형은 분리에 걸리는 시간만큼 소요

용매병과 흡입 필터

펌프보다 위에 두고 프릿을 통해 끌어내린다

펌프로 (to Pump) 통기구 (Vent) 뚜껑 (Cap) 흡입 필터Sinker Frit 이동상 병 속 프릿을 지나한 번 더 걸러짐 펌프오토샘플러 (주입부)컬럼 오븐검출기 용매병은펌프보다 위 기기 맨 위에 용매병 → 중력으로 프릿을 통해 끌어내림
이중 필터

필터링해 채운 이동상이 병 속 Sinker Frit을 한 번 더 지나 펌프·컬럼으로 들어간다

정상(NPLC) vs 역상(RPLC)

어느 쪽이 '센 용매'인가 — 반대다

정상 크로마토그래피 NPLC

Normal phase

극성 정지상 + 극성이 적은 용매

용리 세기는 극성 용매일수록 증가

비극성 n-hexane, n-heptane + 극성 isopropanol, chloroform, ethyl acetate 혼합으로 극성도 조절

역상 크로마토그래피 RPLC

Reversed phase · C18

비극성(약극성) 정지상 + 더 극성인 용매

용리 세기는 극성이 적은 용매일수록 증가

극성인 물 + MeOH, ACN, THF 같은 비극성 용매 혼합으로 극성도 조절

NPLC: 극성 용매일수록 용리 세기 증가 WaterMeOHIPAACNEATHFMCChloroformIsooctaneHexane >>>>>>>>> RPLC (C18): 극성이 적은 용매일수록 용리 세기 증가 극성↑극성↓
극성도 순서

Water > MeOH > IPA > ACN > EA > THF > MC > Chloroform > Isooctane > Hexane · 두세 가지 용매를 섞어 극성도를 맞춘다

RPLC에서 용매의 세기

극성도 P′와 용리 세기 ε⁰ · 용매를 바꿔도 같은 세기를 맞추는 눈금

HOH H₃COH H₃CCN O Water 10.2Methanol 5.1Acetonitrile 5.8Tetrahydrofuran (THF) 4.0 ε⁰(C₁₈) = N/Aε⁰(C₁₈) = 1.0ε⁰(C₁₈) = 3.1ε⁰(C₁₈) = 3.7 극성도 증가 용리 세기 증가 0102030405060708090100 020406080100 0102030405060708090100 ACN/H₂OMeOH/H₂OTHF/H₂O ≈ 70≈ 45 같은 용리 세기의 눈금 (%, v/v) · 60 % ACN ≈ 70 % MeOH ≈ 45 % THF 를 기준으로 한 선형 근사
  • 극성도: 물 10.2 · MeOH 5.1 · ACN 5.8 · THF 4.0
  • ε⁰(C18): MeOH 1.0 · ACN 3.1 · THF 3.7 → 오른쪽일수록 센 용매
예

문헌이 ACN:물 = 60:40이면 같은 용리 세기는 메탄올 약 70 %, THF 약 45 %

등용매 용리 vs 기울기 용리

Isocratic vs Gradient elution

등용매 (Isocratic)

한 가지 용매(또는 균일 혼합물)로 처음부터 끝까지 일정 · 예) 70 % MeOH

간단 · 재평형 불필요

기울기 (Gradient)

A 용매에 B 용매 비율을 시간에 따라 증가

A = 수용성(물) 용매 · B = 유기용매

요즘 기기는 0.1 % 단위까지 조정

재평형 0102030 min 0100B (%)
Time (min)A (%)B (%)
0.017525
2.505050
10.04060
12.50100
20.00100
22.57525
30.07525

예시 프로그램 · A = 수용성(물) 용매, B = 유기용매

표 읽기 + 재평형

75:25 → 2.5분 50:50 → 10분 40:60 → 12.5분 0:100 → 22.5분 75:25로 복귀 후 약 10분 유지 · 액체는 평형이 느려 다음 주입 전 반드시 초기 조성으로

등용매 용리의 한계

90 % → 60 % ACN, 여전히 1·2·3과 6·7이 겹친다

90 % B 0 5 시간 (min) → 1,2,3,4 5,6,7 8 80 % B 0 5 시간 (min) → 1,2,3 4 5 6,7 8 70 % B 0 5 시간 (min) → 1,2,3 4 5 6,7 8 60 % B 0 5 10 시간 (min) → 1 2,3 4 5 6,7 8 흡광도 (220 nm)
  • 90 % B: 모두 5분 이내에 몰려 나옴
  • B를 줄일수록 뒤로 밀리며 분리 (8번 5분 → 13분)
  • 60 %에서도 1·2·3, 6·7 미분리 → 정량·정성 불가
그래서

여러 성분을 동시에 분석할 때는 기울기 용리

기울기 용리의 설계

30 % → 45 % → 80 % B 로 8개 성분을 모두 분리

조성 프로그램(위)과 크로마토그램(아래)

050100 Vol % CH₃CN 30 % CH₃CN 45 % CH₃CN 80 % CH₃CN 0510152025303540 min 흡광도 (220 nm) tm 1 2 3 4 5 6 7 8

  • 30 % B(ACN)로 8분 → 성분 1, 2, 3 분리
  • 5분에 걸쳐 45 %까지 올린 뒤 15분 유지 → 봉우리 4, 5
  • 2분에 걸쳐 80 %로 교체 후 유지 → 나머지 6, 7, 8
    • 머무름 시간은 길어지지만 깨끗한 분리
실무

조성 프로그래밍은 화학 지식 + 시행착오 · 참고문헌과 시뮬레이션 프로그램을 활용

PART 7

pH · 완충용액 · 첨가제

pH, Buffers & Additives

  • 분석물질은 물에서 어떤 형태로 존재하는가
  • 완충용액은 무엇을, 얼마나, 어떻게 쓰는가
  • 첨가제와 희생 염기는 왜 필요한가

어느 것이 주 화학종인가

산·염기·중성형 — Henderson–Hasselbalch 식으로 예측

CO₂H pKa = 4.20 벤조산 (benzoic acid)
HA + H₂O ⇌ A⁻ + H₃O⁺
Ka = [H₃O⁺][A⁻] / [HA] pKa = −log Ka
pH = pKa + log([A⁻] / [HA])
  • 유기화합물 대부분은 산·염기성 → 물에서 해리 HA ⇌ A⁻ + H⁺
    • 중성형 HA (COOH) vs 이온형 A⁻ (COO⁻)
  • pH = pKa → [A⁻]:[HA] = 1:1 (벤조산 pKa 4.20)
  • pH = pKa + 1 (5.20) → 10:1 · pH = pKa − 1 (3.20) → 1:10
요점

수용액의 pH를 조정하면 분석물질을 중성형으로도, 이온형으로도 만들 수 있다 · 이온형은 극성이 커서 역상에서 빨리 나오고 꼬리끌림을 만들기 쉽다

pH에 따른 이온화 — 산과 염기는 반대

pKa ± 2 단위면 사실상 100 %

pKa − 2pKapKa + 2pH → 050100 % 이온화 (%) 산 HA → A⁻pH↑ 이온화 염기 B → BH⁺pH↓ 이온화 ±2 pH 단위 → ~100 % / ~0 % 02468101214pH 050100 분포 (%) pKa 3.74 (COOH)pKa 9.95 (페놀 OH) (a) 비해리(b) COO⁻만(c) 완전 해리 Homovanillic acid — COOH pKa 3.74 · 페놀 OH pKa 9.95
  • Homovanillic acid — COOH pKa 3.74, 페놀 OH pKa 9.95
    • pH 3 (a) 비해리 · pH 6~8 (b) COO⁻만 · pH 13 (c) 완전 해리
규칙

산: pH↑ 이온화 / 염기: pH↓ 이온화 · 작용기별 pKa(카르복실산 0.65~4.76, 아민 4.7~38 …) 표 참고

완충용액 (Buffer solution)

소량의 산·염기가 들어와도 pH가 크게 변하지 않게

02468101214pH 050100 Mol-% H₃PO₄H₂PO₄⁻HPO₄²⁻PO₄³⁻ pKa 2.17.212.3 완충 범위 6.2~8.2 포스페이트 버퍼의 세 완충 범위 중 HPLC에서 가장 흔한 중성 영역
완충제 · 산pKa완충 범위UV cutoffLC-MS
Phosphate (인산)2.14 · 7.20 · 12.331.1~3.1 · 6.2~8.2 · 11.3~13.3< 200 nm✗ 비휘발성
Formate (포름산)3.75––○ 휘발성
Acetate (아세트산)4.76––○ 휘발성

완충제마다 pKa · 완충 범위 · UV 한계 파장이 다르다 → 분석물질의 흡수 파장을 가리지 않는지 확인

  • 약산+짝염기 / 약염기+짝산 · 약전해질 분석물질의 RPLC, IEC에 필수
  • 순수한 물(pH 7)에서 HA → A⁻ 해리 → 꼬리끌림
포스페이트 버퍼

완충 범위 3개(1.1~3.1 / 6.2~8.2 / 11.3~13.3), UV cutoff < 200 nm → HPLC-UV의 표준 · LC-MS에서는 사용 금지 — 비휘발성이라 인터페이스에 석출

완충용액의 농도와 취급

25~100 mM · 수용액 pH 먼저 · 미생물 · 세척

25–100 mMHPLC 완충용액 농도
낮으면 완충 효과 없음 · 높으면 피크 왜곡
  • 먼저 수용액 pH 조절 → 그 다음 유기용매 첨가
  • pH 변화 원인: CO₂ 유입, 유기용매 증발, 시료 희석제
  • 미생물 억제: 0.1 % sodium azide
  • 실험 후 물로 충분히 세척 → 100 % 메탄올로 채움
(a) 시간 (min) · Column A (b) 시간 (min) · Column B (c) 시간 (min) · Column C (d) 시간 (min) · Column A (e) 시간 (min) · Column B (f) 시간 (min) · Column C

위: 2 mM 아세트산 소듐 (피크 왜곡) · 아래: 25 mM (샤프)

첨가제와 희생 염기

양성자화된 염기 + 잔류 실란올 = 꼬리끌림

  • 첨가제 — 완충용액은 아니지만 이동상 pH를 바꾸는 화합물
    • TFA(0.3), 인산(2.14/7.20/12.33), 시트르산, 포름산(3.75), 아세트산(4.76), TEA(10.21) …
  • 문제 — NH₃⁺ 형태의 염기가 잔류 실란올(Si–O⁻)과 2차 상호작용 → 머무름 길어지고 피크 왜곡
  • 해법 1 — pH를 올려 중성형(NH₂)으로 · 그러나 실리카 컬럼은 pH 2.5~7 한계
  • 해법 2 — 희생 염기 TEA, piperazine, TMEDA, DMOA 첨가

희생 염기의 작용

정지상 (C18 + 잔류 실란올) · 실리카 표면 이동상 SiSiSi O⁻O⁻O⁻ SiSi CH₃CH₃CH₃CH₃ C₁₈C₁₈ NH₃⁺ 암페타민 (염기, 양성자화) 2차 상호작용 Et₃NH⁺Et₃NH⁺Et₃NH⁺ TEA(트라이에틸아민)가 실란올 자리를 먼저 차지 NH₃⁺ 암페타민 C18과만 소수성 상호작용 꼬리끌림 (tailing) 대칭 피크 (As ≈ 1)

희생 염기의 작용

TEA(양성자화)가 표면의 실란올기와 먼저 결합해 자리를 막는다 → 암페타민 같은 염기성 분석물질은 C18과만 상호작용

TEA 첨가에 따른 피크 모양의 변화

꼬리끌림 인자 As = b/a · 1.0이면 완전 대칭

051015202530354045TEA 농도 (mM) 0.512344.5 꼬리끌림 인자 (As) As 4.2 (TEA 0) As 1.2 (TEA 40 mM) 불량불량양호우수 As = 4As = 2As = 1.2As = 1.0~1.05 ab As = b / a앞쪽 폭 a · 뒤쪽 폭 b 1 2,3 4 5 6 7 pH 7 20 mM Na₂HPO₄ · pH 7 1 2 3 4 5 6 pH 11 20 mM TEA · pH 11
  • TEA 0 → 40 mM: As 4.2 → 1.2 · 불량(4, 2) / 양호(1.2) / 우수(1.0~1.05)
실제 크로마토그램

20 mM Na₂HPO₄ pH 7: 2·3번 미분리 → 20 mM TEA pH 11: 2·3번 분리, 피크 모양 개선

퀴즈 2 — 이동상 확인

오늘 배운 내용으로 답변 가능 · 번호를 클릭하면 힌트

문헌 조건이 ACN:물 = 60:40인데 우리 실험실에는 메탄올뿐이다. 몇 %로 시작해야 하는가?
힌트 — 용매 세기 눈금표 · 약 70 % MeOH
기울기 용리에서 마지막 조성을 처음과 같게 하고 10분 유지하는 이유는?
힌트 — 액체의 평형은 느리다 · 다음 주입의 머무름 시간 재현
LC-MS에서 포스페이트 버퍼 대신 무엇을 쓰고, 왜 그런가?
힌트 — 휘발성 완충제(포름산·아세트산 암모늄) · 인터페이스 석출

오늘의 정리

HPLC의 원리 여섯 문장

  1. 크로마토그래피 = 이동상과 정지상 사이의 분배 · HPLC는 액체 이동상 + 고압(6,000 psi)
  2. 정성 = 표준물질 머무름 시간 일치 · 정량 = 피크 면적 + 검정곡선
  3. 주입은 액체 시료 10~20 µL, 1~100 ppm · 6-port 밸브 루프가 부피를 결정
  4. C18 실리카 정지상: 소수성 상호작용 · pH 3~8 · 입자 작을수록 고효율·고압 · 세정은 이동상 부피 20배
  5. 역상에서 용매 극성↓ = 용리 세기↑ · 여러 성분은 기울기 용리 · 재평형 필수
  6. pH로 이온화 조절 · 완충용액 25~100 mM(포스페이트, LC-MS 제외) · 희생 염기로 실란올 꼬리끌림 억제
핵심 용어

이동상 · 정지상 · 머무름 시간 · 검정곡선 · dead volume · 6-port valve · ODS(C18) · 실란올 · van Deemter · 용리 세기 · isocratic · gradient · 재평형 · pKa · Henderson–Hasselbalch · 완충 범위 · UV cutoff · 꼬리끌림 인자 · 희생 염기

HPLC 원리 1–8강 정리

Q and A

“HPLC의 분리는 정지상과 이동상 사이의 분배이고, 실무에서 그 분배를 바꾸는 손잡이는 이동상의 극성과 pH다.”